李 洋，趙明鏡，王保福，劉 穎，金秋碩，韓小婉，李 彤，孟 慧

微粒(microparticles，MPs)是細(xì)胞外囊泡的一種，也被稱為微囊泡，是細(xì)胞在活化或凋亡的過(guò)程中由細(xì)胞膜出芽脫落形成的直徑在100～1 000 nm的小囊泡，攜帶來(lái)源于其母細(xì)胞的mRNA、microRNAs(miRNAs)、受體及特異性蛋白等，主要通過(guò)膜融合、內(nèi)吞、配體與受體結(jié)合的方式將其攜帶的特異蛋白或遺傳物質(zhì)傳遞給靶細(xì)胞，影響靶細(xì)胞的功能[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，微粒能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，參與血管炎癥、凝血、血栓形成和鈣化等病理進(jìn)程，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展[1，3-4]。其中白細(xì)胞微粒(leukocyte-derived microparticles，LMPs)幾乎參與AS的所有病理進(jìn)展，臨床研究發(fā)現(xiàn)AS病人斑塊中的微粒大部分是LMPs，而LMPs中又以巨噬細(xì)胞來(lái)源的微粒居多[5]，且泡沫細(xì)胞比正常的巨噬細(xì)胞釋放更多的微粒[6]。巨噬細(xì)胞極化是巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境的刺激下定向分化為多種亞型的過(guò)程[7]。在AS發(fā)生發(fā)展中，巨噬細(xì)胞主要以M1型(促炎型)和M2型(抗炎型)存在，M1型和M2型巨噬細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡，不僅決定了炎癥的最終轉(zhuǎn)歸，而且與AS斑塊的穩(wěn)定性和疾病的輕重程度密切相關(guān)[7-8]。那么，巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞作為AS炎癥病理機(jī)制的核心環(huán)節(jié)，二者來(lái)源的微粒是否參與巨噬細(xì)胞M1型和M2型的失衡，二者作用是否有差異，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組前期研究顯示，頸動(dòng)脈粥樣硬化(CAS)人群的LMPs與巨噬細(xì)胞亞型具有一定關(guān)系，可能參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化。因此，本研究通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞來(lái)源的微粒(macrophage-derived microparticles，M-MPs)和泡沫細(xì)胞來(lái)源的微粒(foam cell-derived microparticles，F(xiàn)C-MPs)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)行探討，以期為后續(xù)AS的臨床與基礎(chǔ)研究提供思路及方法。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人單核細(xì)胞系(THP-1)細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞資源中心；試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基(索萊寶，貨號(hào)31800)、胎牛血清(FBS，GIBCO，貨號(hào)10099-141C)、佛波酯(PMA，Sigma，貨號(hào)P1585)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL，廣州奕元，貨號(hào)YB-002)、無(wú)外泌體血清(宇玫博生物，貨號(hào)UR50202)、飽和油紅O染色劑(索萊寶，貨號(hào)G1260)、絕對(duì)計(jì)數(shù)用微球試劑盒(Beckman，貨號(hào)7547053)、PKH26熒光染料(Umibio，貨號(hào)UR50202)、DAPI封片劑(中杉金橋，貨號(hào)ZLI-9557)；Annexin-Ⅴ(BD，貨號(hào)550474)、CD206(BD，貨號(hào)550889)、CD11b(BD，貨號(hào)562793)、CD11c(BD，貨號(hào)555392)、CD68(abcam，貨號(hào)ab213363)。主要儀器：培養(yǎng)箱(日本SANYO公司生產(chǎn))、醫(yī)用離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))、4 ℃離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn))、Cytoflex LX流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn))、TCS SP8X激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica顯微系統(tǒng)有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞使用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液1次，每4天傳代1次，傳至3～5代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用含100 ng/mL PMA的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1×106個(gè)/mL THP-1細(xì)胞24 h可將THP-1誘導(dǎo)為M0型巨噬細(xì)胞(靜息型)[9-11]，再以含3%無(wú)外泌體血清和80 μg/mL ox-LDL的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h可將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞[12]，以M0型巨噬細(xì)胞加入含3%無(wú)外泌體血清和無(wú)ox-LDL的RPMI 1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h作為對(duì)照。

1.2.1.2 巨噬細(xì)胞CD68免疫組化鑒定 將誘導(dǎo)得到的M0型巨噬細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，然后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3次，每次5 min，再用3%過(guò)氧化氫(H2O2)孵育10 min后加山羊血清室溫下封閉15 min，加CD68抗體(濃度1∶100)4 ℃過(guò)夜孵育，次日加入增強(qiáng)液及二抗后使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，再用乙醇梯度各脫水3 min、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.2.1.3 泡沫細(xì)胞油紅O染色 油紅O 存儲(chǔ)液和去離子水以3∶2比例進(jìn)行稀釋，濾紙過(guò)濾后室溫下放置10 min待用。棄去泡沫細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 輕緩漂洗1～2 遍，去除殘余培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min。在上述泡沫細(xì)胞加入油紅O染液染色15 min，棄去染液，加入PBS漂洗2～3遍后加入60%異丙醇，分色數(shù)秒鐘，去除非特異性染色，最后加入蘇木素染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染(鏡下觀察細(xì)胞核著色后即可終止，避免過(guò)度著色)，顯微鏡下觀察細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。

1.2.2 不同來(lái)源LMPs的提取及鑒定 依據(jù)1.2.1中的方法誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞，分別收集兩種細(xì)胞的上清液，以4 ℃、1 600 g離心5 min，取上清液去沉淀以去除細(xì)胞碎片，再以4 ℃、16 000 g離心40 min進(jìn)行第二步離心，棄上清，將沉淀用200 μL無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，得到M-MPs和FC-MPs[13]。

鑒定微粒大?。哼\(yùn)用 Cytoflex流式細(xì)胞儀通過(guò)前向角(FSC)/側(cè)向角(VSSC)確定 100 nm和1 000 nm微珠的位置，圈定100～1 000 nm之間的區(qū)域，即為微粒的門。M-MPs與FC-MPs懸液各取10 μL，分別加入5 μL Annexin-Ⅴ(微粒特征性蛋白)[14]避光孵育20 min，然后加入RPMI 1640稀釋10倍，充分混勻后分別上機(jī)檢測(cè)。同樣電壓條件下分布于微粒門內(nèi)且Annexin-Ⅴ陽(yáng)性表達(dá)的囊泡即為M-MPs與FC-MPs。

1.2.3 不同來(lái)源LMPs的數(shù)量及標(biāo)志物的差異

1.2.3.1 微粒計(jì)數(shù) 取10 μL M-MPs與FC-MPs懸液，加入5 μL Annexin-Ⅴ避光孵育20 min后加入10 μL的絕對(duì)計(jì)數(shù)微球與90 μL的PBS，充分混勻后上機(jī)檢測(cè)，分別計(jì)算FC-MPs與M-MPs個(gè)數(shù)[6]，n=3。絕對(duì)計(jì)數(shù)微球設(shè)門見(jiàn)圖1。

圖1 絕對(duì)計(jì)數(shù)微球設(shè)門

1.2.3.2 M-MPs與FC-MPs標(biāo)志物 各取10 μL M-MPs與FC-MPs加入5 μL Annexin-Ⅴ與CD11b(巨噬細(xì)胞特征性蛋白)[15]避光孵育20 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，n=5。

1.2.4 不同來(lái)源的LMPs與巨噬細(xì)胞結(jié)合的示蹤實(shí)驗(yàn) 計(jì)數(shù)后將微粒懸液濃度調(diào)整為1×109個(gè)/mL，加入PKH26熒光染料避光孵育10 min，4 ℃、16 000 g離心40 min，棄掉多余染料，取沉淀，用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸后加入誘導(dǎo)好的M0型巨噬細(xì)胞爬片中培養(yǎng)24 h，PBS洗3遍，4%細(xì)胞固定液固定15 min后再次用PBS洗3遍后DAPI封片，激光共聚焦于561 nm波長(zhǎng)下觀察并拍照[16]。

1.2.5 不同來(lái)源LMPs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響 將M-MPs和FC-MPs分別通過(guò)絕對(duì)計(jì)數(shù)微球測(cè)得濃度，并將兩種LMPs濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL、1×107個(gè)/mL及1×108個(gè)/mL，加入提前誘導(dǎo)好的M0型巨噬細(xì)胞中，對(duì)照組只加RPMI 1640培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組、M-MPs組(1×106M-MPs組、1×107M-MPs

組及1×108M-MPs組)、FC-MPs組(1×106FC-MPs組、1×107FC-MPs組及1×108FC-MPs組)。24 h后收集各組巨噬細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min(2次)，取沉淀用200 μL的PBS重懸后加入5 μL人Fc-block避光封閉10 min，再加入CD11b、CD11c、CD206抗體(CD11b+CD11c+CD206-為M1亞型，CD11b+CD11c-CD206+為M2亞型)[15，17-20]避光孵育20 min，孵育結(jié)束后再次以3 000 r/min離心5 min洗脫未結(jié)合的抗體，加入200 μL PBS重懸巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞的表型。

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定 正常THP-1細(xì)胞為懸浮生長(zhǎng)的圓形細(xì)胞，經(jīng)PMA誘導(dǎo)24 h后分化為貼壁的圓盤形或梭形等多形態(tài)的巨噬細(xì)胞。詳見(jiàn)圖2A、2B。對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行CD68免疫組化鑒定，結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)CD68抗原特異性染成棕黃色，為陽(yáng)性反應(yīng)，空白對(duì)照組無(wú)特異性染色。詳見(jiàn)圖2C、圖2D。由此可以看出，THP-1在PMA誘導(dǎo)24 h后分化為巨噬細(xì)胞。對(duì)泡沫細(xì)胞及同期生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，兩組細(xì)胞比較可見(jiàn)泡沫細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂質(zhì)顆粒，巨噬細(xì)胞不著色。詳見(jiàn)圖2E、2F。說(shuō)明80 μg/mL ox-LDL誘導(dǎo)48 h可將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞。

2.2 不同來(lái)源的LMPs大小及形態(tài)鑒定 微粒是直徑在100～1 000 nm的微小囊泡，為明確實(shí)驗(yàn)所獲得的沉淀是否是微粒，本研究使用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行鑒定，圈定100～1 000 nm的區(qū)域?yàn)槲⒘５拈T。微粒在形成過(guò)程中會(huì)有大量的磷脂酰絲氨酸外翻，是微粒表面表達(dá)的特異性標(biāo)志物，可作為微粒鑒定的標(biāo)準(zhǔn)之一，因此，選擇Annexin-Ⅴ標(biāo)記微粒。流式結(jié)果顯示，在100～1 000 nm的門中，存在大量Annexin-Ⅴ陽(yáng)性表達(dá)的囊泡。詳見(jiàn)圖3。以上結(jié)果可說(shuō)明離心獲取的沉淀為微粒。

圖2 巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的鑒定

圖3 MPs大小鑒定

2.3 M-MPs與FC-MPs數(shù)量及標(biāo)志物的差異

2.3.1 M-MPs與FC-MPs數(shù)量的差異 用Annexin-Ⅴ標(biāo)記微粒后結(jié)果顯示：與巨噬細(xì)胞相比較，相同培養(yǎng)條件下泡沫細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多數(shù)量的FC-MPs，M-MPs平均數(shù)量為3.4×106個(gè)/μL，F(xiàn)C-MPs平均數(shù)量為6.9×106個(gè)/μL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4。

圖4 FC-MPs與M-MPs數(shù)量比較

2.3.2 M-MPs和FC-MPs標(biāo)志物CD11b的表達(dá) 用Annexin-Ⅴ+CD11b+標(biāo)記巨噬細(xì)胞來(lái)源的微粒。相同濃度的M-MPs與FC-MPs進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C-MPs雖有升高，但M-MPs和FC-MPs的CD11b水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖5。

2.4 不同來(lái)源的LMPs與巨噬細(xì)胞結(jié)合示蹤結(jié)果 在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，用紅色熒光染料標(biāo)記的M-MPs和FC-MPs均與巨噬細(xì)胞緊密接觸或已進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)，提示兩種微粒均與巨噬細(xì)胞發(fā)生作用。詳見(jiàn)圖6。

圖5 M-MPs與FC-MPs的CD11b表達(dá)水平比較

圖6 不同來(lái)源的LMPs與巨噬細(xì)胞結(jié)合示蹤結(jié)果(×400)

2.5 不同來(lái)源LMPs對(duì)于巨噬細(xì)胞表型的影響

2.5.1 M-MPs對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響 不同亞型的巨噬細(xì)胞表面攜帶的標(biāo)志物有明顯異同，CD11b+CD11c+CD206-為巨噬細(xì)胞M1亞型，CD11b+CD11c-CD206+為巨噬細(xì)胞M2亞型。與對(duì)照組相比，1×107個(gè)/mL和1×108個(gè)/mL濃度M-MPs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1型百分比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且1×107個(gè)/mL組和1×108個(gè)/mL組M1型百分比高于1×106個(gè)/mL組(P<0.01)。M-MPs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型百分比與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但1×108個(gè)/mL組較對(duì)照組有降低趨勢(shì)(P=0.085)。與對(duì)照組巨噬細(xì)胞M1/M2比值相比，M-MPs 3個(gè)濃度組的M1/M2比值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但1×108個(gè)/mL組較對(duì)照組M1/M2比值有升高趨勢(shì)(P=0.077)。詳見(jiàn)表1、圖7。

2.5.2 FC-MPs對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響 與對(duì)照組比較，F(xiàn)C-MPs的1×107個(gè)/mL和1×108個(gè)/mL兩個(gè)濃度所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1亞型百分比明顯增高(P<0.05)。與FC-MPs 1×106個(gè)/mL組相比，1×107個(gè)/mL和1×108個(gè)/mL FC-MPs組M1型巨噬細(xì)胞有明顯升高趨勢(shì)(P=0.057，P=0.053)。FC-MPs的3個(gè)濃度組均可使M2型巨噬細(xì)胞百分比降低，且FC-MPs 1×108個(gè)/mL濃度組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在M1/M2比值方面，F(xiàn)C-MPs 1×108個(gè)/mL組具有明顯的升高作用且有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，1×108個(gè)/mL組的M1/M2比值與對(duì)照組、1×106個(gè)/mL組及1×107個(gè)/mL組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表1、圖8。

2.5.3 相同濃度的M-MPs與FC-MPs對(duì)巨噬細(xì)胞亞型的影響 對(duì)同一濃度下M-MPs與FC-MPs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1、M2及M1/M2比值相比較發(fā)現(xiàn)，同一濃度下FC-MPs誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞百分比更低，M1/M2比值更大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 不同來(lái)源的LMPs對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響(±s，n=5)

④P<0.05，⑤P<0.01。

圖7 不同濃度的M-MPs對(duì)巨噬細(xì)胞亞型表達(dá)的影響

圖8 不同濃度的FC-MPs對(duì)巨噬細(xì)胞亞型表達(dá)的影響

3 討 論

微?？捎砂准?xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等幾乎所有細(xì)胞產(chǎn)生，并釋放到血漿、尿液、汗液、唾液、淚液等不同體液和體外培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，是一種新型的“液體活檢”指標(biāo)[2，21]，在腫瘤、心血管疾病、糖尿病和腎病方面得到廣泛研究。查閱文獻(xiàn)可知，目前研究較多的內(nèi)皮細(xì)胞微粒、血小板微粒和LMPs均可導(dǎo)致AS，而AS是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)[1，22-24]。

LMPs來(lái)源于粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)、修飾內(nèi)皮功能、促凝血、促進(jìn)血栓形成及促進(jìn)易損斑塊內(nèi)新生血管形成的作用[5，25]，幾乎參與AS形成的所有階段。在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，當(dāng)巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流入增加、清除減少時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，產(chǎn)生大量的炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、前列環(huán)素E2(PGE2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)[26-27]，同時(shí)釋放微粒，微粒又可繼續(xù)刺激巨噬細(xì)胞與泡沫細(xì)胞產(chǎn)生更多的微粒和炎性因子，形成惡性循環(huán)，加重AS的病變[28]。在本研究中，巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞均能產(chǎn)生大量的微粒，泡沫細(xì)胞產(chǎn)生的微粒平均數(shù)量為6.9×106個(gè)/μL，而巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的微粒平均數(shù)量為3.4×106個(gè)/μL，數(shù)量相差2倍。Niu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，AS病人血漿中的白細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡數(shù)量顯著高于正常人；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡比正常巨噬細(xì)胞多；Krankel等[29]研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。由于微粒是在細(xì)胞活化或凋亡時(shí)產(chǎn)生的，所以，這種數(shù)量上的差異可能與巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的活化狀態(tài)有關(guān)，預(yù)示著FC-MPs具有更強(qiáng)的致炎性。

已知微粒攜帶來(lái)源于其母細(xì)胞的DNA、RNA、受體和特異性蛋白，主要通過(guò)膜融合、內(nèi)吞、配體與受體結(jié)合的方式作用于靶細(xì)胞，影響靶細(xì)胞的功能，參與多種病理生理過(guò)程[21，30]。本研究使用PKH26染料分別標(biāo)記M-MPs及FC-MPs后與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，M-MPs和FC-MPs均可與巨噬細(xì)胞緊密接觸或已進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)，提示兩種微粒均與巨噬細(xì)胞發(fā)生結(jié)合，而這種結(jié)合是M-MPs和FC-MPs對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生作用的基礎(chǔ)。但微粒具體是通過(guò)何種方式與巨噬細(xì)胞結(jié)合還需要進(jìn)一步的研究，如采用活細(xì)胞成像技術(shù)對(duì)微粒與巨噬細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。

研究發(fā)現(xiàn)，AS斑塊中存在促炎型巨噬細(xì)胞(其亞型有M1型、M4型和Mox型)和抗炎型巨噬細(xì)胞[其亞型有M2型、M(Hb)型和Mhem型]，兩類亞型分別以M1型(經(jīng)典活化型)和M2型(替代活化型)為主要代表[7-8]。M1型巨噬細(xì)胞大量分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、白細(xì)胞介素-23(IL-23)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)等炎性因子，促進(jìn)AS發(fā)展；M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌高水平的白細(xì)胞介素-10(IL-10)、CD163、DC-SIGN(CD209)、清道夫受體、甘露糖受體(CD206)和精氨酸酶，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，穩(wěn)定斑塊[8]。M1型和M2型巨噬細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡，不僅決定了炎癥的最終轉(zhuǎn)歸，而且與AS斑塊的穩(wěn)定性和疾病的輕重程度密切相關(guān)[7]。

查閱文獻(xiàn)得到巨噬細(xì)胞共表達(dá)的表型標(biāo)記物有CD45、CD11b、CD86、CD14和CD68等，M1型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物有CD11c、IL-6、IL-12和TNF-α等，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物有CD206、CD16、IL-4受體α鏈(IL-4Rα)和IL-10等[15，17-20]。因此，本研究采用CD11b+CD11c+CD206-和CD11b+CD11c-CD206+分別作為M1型和M2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物[15，17-20]。結(jié)果顯示，M-MPs與FC-MPs均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促炎表型，即M1型極化，說(shuō)明兩種微粒均可促進(jìn)炎癥過(guò)程，加重AS的發(fā)展。同時(shí)FC-MPs比M-MPs更能抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化，巨噬細(xì)胞M2型表達(dá)降低意味著其抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊的功能下降，且FC-MPs導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M1/M2型比值更高、失衡更明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道，泡沫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡(FC-EVs)與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡(M-EVs)之間有269個(gè)蛋白具有差異，其中FC-EVs的大部分差異是由于表達(dá)增加導(dǎo)致的[6]。而微粒屬于細(xì)胞外囊泡的一類，同樣攜帶有其母細(xì)胞的遺傳信息及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，Garzetti等[31]對(duì)M1型和M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的微粒內(nèi)容物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，M1型和M2型巨噬細(xì)胞來(lái)源的微粒攜帶不同的mRNAs，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為與微粒母細(xì)胞相同的表型。這些結(jié)果提示M-MPs與FC-MPs的蛋白質(zhì)或mRNAs表達(dá)的差異性可能是造成二者導(dǎo)致巨噬細(xì)胞極化程度不同的原因。

綜上所述，本研究通過(guò)THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞與泡沫細(xì)胞，分別提取二者產(chǎn)生的微粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，觀察M-MPs與FC-MPs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種微粒均可與巨噬細(xì)胞結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化，說(shuō)明M-MPs與FC-MPs均可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向促炎型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。但相同條件下，泡沫細(xì)胞能夠比巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的微粒，且FC-MPs抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化更顯著，說(shuō)明FC-MPs數(shù)量更多，抑制抗炎作用和促進(jìn)M1/M2型失衡更明顯，預(yù)示著FC-MPs具有更高的促炎效能。以上結(jié)果提示，在進(jìn)行AS的研究中，多種因素可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化，除傳統(tǒng)病理因素外，LMPs是非常強(qiáng)的影響巨噬細(xì)胞極化的因素，為L(zhǎng)MPs作為AS的臨床標(biāo)志物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)LMPs中代表性的M-MPs和FC-MPs的作用既有聯(lián)系又有區(qū)別，在臨床與基礎(chǔ)研究中要特別關(guān)注FC-MPs在AS中的獨(dú)特作用和價(jià)值。