陳 莉，范曉迪，史大卓，白瑞娜

血管內(nèi)皮損傷是高血壓[1]、腦梗死[2]、冠心病[3]等多種心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病變的起始階段。內(nèi)皮細(xì)胞損傷可引起白細(xì)胞黏附聚集、血小板活化、炎癥介質(zhì)和炎性因子釋放及血栓形成等多種病理改變[4-5]。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮功能成為防治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的重要研究方向。既往研究顯示，核因子-κB(NF-κB)活化可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，加劇血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[6-7]。YY1為鋅指蛋白家族亞組成員之一的多功能轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[8-9]。NF-κB可通過(guò)結(jié)合到Y(jié)Y1的啟動(dòng)區(qū)以調(diào)控其表達(dá)，發(fā)揮促AS的作用[10]。前期研究表明，NF-κB/YY1信號(hào)通路在血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。芍藥苷是從赤芍中提取的單體成分，屬于單萜類化合物?，F(xiàn)代藥理研究顯示，芍藥苷具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗血小板聚集、抗血栓等多種生物學(xué)活性，臨床中廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的防治[11-13]。有研究顯示，芍藥苷可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路改善炎癥反應(yīng)，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[14]?；诖?，本研究構(gòu)建腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷的體外模型，探討芍藥苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及對(duì)NF-κB/YY1信號(hào)通路的影響，以期為防治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HUVECs細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司(貨號(hào)：8000)。TNF-α 購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司(批號(hào)：300-01A)，雙氧水充分溶解，0.22 μmol/L孔徑濾膜過(guò)濾，配成20 ng/mL的母液，-20 ℃冰箱分裝保存?zhèn)溆?。芍藥?批號(hào)：CP8129)購(gòu)自中國(guó)碧云天公司，純度>98%。將48 mg芍藥苷溶解于500 μL的二甲基亞砜(DMSO)中，充分溶解，過(guò)濾，配成200 μmol/L母液，-20 ℃冰箱分裝保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM，批號(hào)：#1001)、胎牛血清(批號(hào)：#0025)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子添加物(批號(hào)：#1052)均購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。胰蛋白酶(trypsinase，批號(hào)：SH40003.01)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS，批號(hào)：SH30256.01)均購(gòu)自美國(guó)life sciences公司。Trizol Reagent(批號(hào)：#15596018)購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。BCA蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)：P0012)購(gòu)自中國(guó)碧云天公司。細(xì)胞毒性活性檢測(cè)試劑盒(CCK-8，批號(hào)：CK04)購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司。白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒(批號(hào)：EK1062)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)試劑盒(批號(hào)：EK1082)均購(gòu)自中國(guó)聯(lián)科生物科技有限公司。M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Agarose均購(gòu)自Promega公司(批號(hào)：131819)。Real-time PCR擴(kuò)增試劑盒(批號(hào)：18570700)購(gòu)自中國(guó)中原領(lǐng)先科技有限公司。Anti-NF-κB p65抗體(ab32536)、Anti-YY1抗體(ab109237)、Anti-COX-2抗體(ab179800)均購(gòu)自美國(guó)ABcam生物科技有限公司。actin抗體(批號(hào)：TA-09)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG(H+L，批號(hào)：ZB-2301)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自BINTA公司。計(jì)算機(jī)圖像分析儀(Image-Pro Plus Analysis Soft war)、Trans-blot sp cell型半干轉(zhuǎn)印槽、Mini-PROTEAN Tetra Cell型電泳槽系統(tǒng)、PowerPac universal power supply型通用電泳儀電源均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。核酸紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Biophotometer公司。AE2000型倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)購(gòu)自中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。Synergy H1型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs培養(yǎng)和干預(yù) HUVECs用含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和1%的青鏈霉素的ECM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第4代～第7代細(xì)胞，以6 103個(gè)/mL的密度鋪于96孔板中，孵育24 h，然后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后分別加入不同濃度的TNF-α(0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL)和芍藥苷(0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L、320 μmol/L)培養(yǎng)24 h，以確定TNF-α造模濃度和芍藥苷的干預(yù)濃度。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組、模型組、中劑量芍藥苷組、高劑量芍藥苷組。空白對(duì)照組為正常培養(yǎng)的HUVECs，模型組加入20 ng/mL TNF-α干預(yù)24 h，中劑量芍藥苷組和高劑量芍藥苷組提前2 h分別給予芍藥苷(80 μmol/L或160 μmol/L)，再加入TNF-α 20 ng/mL共同干預(yù)24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)HUVECs增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，用培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以每孔細(xì)胞密度為6 103個(gè)/mL、培養(yǎng)液100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，按1.2.1實(shí)驗(yàn)步驟干預(yù)24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入含10%CCK-8溶液的100 μL培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值(A)，以每組6個(gè)復(fù)孔吸光度值計(jì)算各濃度組的均值。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)炎性因子IL-6、IL-8 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，以6×103個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，先給予芍藥苷預(yù)處理2 h，再給予TNF-α共同干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞上清液至新的EP管中，300 g離心10 min，去除沉淀物，即刻檢測(cè)。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，每孔分別加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及樣品。各孔加入50 μL稀釋的檢測(cè)抗體封板室溫孵育2 h，再加入100 μL稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素，室溫孵育45 min，洗液后加入顯色底物TMB及終止液。酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)NF-κB和YY1基因表達(dá) 以6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL，先給予芍藥苷預(yù)處理2 h，再給予TNF-α共同干預(yù)24 h后，棄去上清液，用預(yù)溫的PBS洗3次后，每孔加入800 μL Trizol裂解后收集細(xì)胞組織于離心管中，再分別加入氯仿200 μL、異丙醇500 μL提取細(xì)胞中RNA，核酸紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度。M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。NF-κB正向引物：5′-GGGATGGCTTCTATGAGGCT -3′，反向引物：5′-CTGACTGATAGCCTGCTCCA -3′；YY1正向引物：5′-GTGTGGAGACACACAGATGC-3′，反向引物：5′-ACTGTGCTCCTCATTCCCAA-3′；GAPDH正向引物：5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′，反向引物：5′-GACTGTGGTCATGAGTCCT-3′。采用相對(duì)定量2-△△CT法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)NF-κB、YY1、環(huán)氧化酶-2(COX-2)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL密度接種在60 mm的培養(yǎng)皿中，先給予芍藥苷預(yù)處理2 h，再給予TNF-α共同干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞于EP管中，每管加入100 μL高效RIPA裂解液，冰上裂解30 min后，提取總蛋白，然后按照BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白樣品(每孔10 μg)，進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后剪膜，孵育NF-κB、YY1、環(huán)氧化酶-2(COX-2，1∶1 000)及β-actin(1∶500)一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗5次，每次6 min，加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG(H+L)二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，TBST洗5次，每次6 min，ECL發(fā)光液加到膜上反應(yīng)，曝光，凝膠圖像分析拍照并對(duì)凝膠條帶信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。采用Quantity One(BIORAD公司)軟件測(cè)量各個(gè)顯色條帶的吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 芍藥苷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs增殖活性的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，隨著TNF-α劑量增加，其對(duì)HUVECs活力的抑制作用增強(qiáng)(P<0.01或P<0.001)。詳見(jiàn)圖1、表1。顯著誘導(dǎo)炎性因子IL-6的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)圖2、表2。根據(jù)TNF-α對(duì)細(xì)胞活力和IL-6表達(dá)的影響，本研究選擇20 ng/mL TNF-α來(lái)誘導(dǎo)HUVECs的炎癥反應(yīng)，給予芍藥苷提前干預(yù)2 h后，加用TNF-α(20 ng/mL)來(lái)誘導(dǎo)HUVECs炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，芍藥苷(80 μmol/L和160 μmol/L)能促進(jìn)受損細(xì)胞的活力修復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、表3。因此，選取芍藥苷80 μmol/L和160 μmol/L來(lái)觀察其對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

與0 ng/mL組比較，＊P<0.01，#P<0.001。

表1 不同濃度TNF-α誘導(dǎo)HUVECs活力比較(±s)

與0 ng/mL組比較，＊P<0.001。

表2 不同濃度TNF-α誘導(dǎo)炎性因子IL-6表達(dá)水平比較(±s) 單位：ng/mL

與空白對(duì)照組比較，＊P<0.001；與模型組比較，#P<0.05。

表3 不同濃度芍藥苷對(duì)HUVECs活力的影響(±s)

2.2 芍藥苷對(duì)HUVECs炎性介質(zhì)IL-6、IL-8和COX-2表達(dá)的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組炎性因子IL-6、IL-8表達(dá)明顯上升(P<0.001)；與模型組相比，不同劑量的芍藥苷預(yù)處理后，炎性因子IL-6和IL-8表達(dá)均下降，芍藥苷高劑量組(160 μmol/L)下降更明顯(P<0.01)。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組COX-2表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.001)；與模型組相比，不同劑量的芍藥苷預(yù)處理后，COX-2表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。詳見(jiàn)圖4、表4。結(jié)果表明，芍藥苷呈劑量依賴性抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs炎性因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)。

與空白對(duì)照組比較，＊P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。

表4 各組IL-6、IL-8、COX-2水平比較(±s)

2.3 芍藥苷對(duì)NF-κB和YY1 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組NF-κB和YY1基因表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.001)；與模型組相比，不同劑量芍藥苷組NF-κB和YY1基因表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)，且高劑量芍藥苷組的效果優(yōu)于中劑量芍藥苷組。詳見(jiàn)圖5、表5。結(jié)果表明，芍藥苷能呈劑量依賴性抑制TNF-α誘導(dǎo)NF-κB和YY1基因的表達(dá)。

與空白對(duì)照組比較， ＊P<0.001；與模型組比較，#P<0.01。

表5 各組NF-κB、YY1 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

2.4 芍藥苷對(duì)HUVECs細(xì)胞NF-κB和YY1蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組NF-κB和YY1蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，不同劑量芍藥苷組，NF-κB和YY1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。芍藥苷呈劑量依賴性抑制NF-κB和YY1的蛋白表達(dá)，說(shuō)明芍藥苷可從蛋白水平抑制NF-κB/YY1信號(hào)通路的活化，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。詳見(jiàn)表6、圖6。

表6 各組NF-κB、YY1蛋白表達(dá)水平比較(±s)

與空白對(duì)照組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。

3 討 論

AS是多種心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，炎癥反應(yīng)貫穿AS發(fā)生發(fā)展的始終[15]。研究發(fā)現(xiàn)，AS進(jìn)程中炎癥反應(yīng)、血小板黏附聚集和血栓形成與中醫(yī)學(xué)“血脈瘀阻”理論密切相關(guān)[16-17]。在此認(rèn)識(shí)的指導(dǎo)下，形成了理氣活血化瘀、益氣活血化瘀和溫陽(yáng)活血化瘀等系列治法和有效方藥[18-19]?；诖耍钊胙芯炕钛鲋兴帉?duì)AS進(jìn)程中血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制，有助于為臨床應(yīng)用活血化瘀中藥治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病提供可靠依據(jù)。

NF-κB是Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，其中NF-κB p65亞單位是NF-κB家族中參與炎癥反應(yīng)的主要成員之一，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[20-21]。YY1為多功能的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與特異性DNA序列結(jié)合以調(diào)控下游基因的表達(dá)[22-23]。IL-6是重要的促炎因子之一，不僅能夠誘導(dǎo)C-反應(yīng)蛋白(CRP)、血清淀粉樣蛋白和纖維蛋白原的合成，而且能促進(jìn)急性炎癥反應(yīng)的發(fā)展[24-25]。IL-8屬于CXC趨化因子家族成員之一，能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的黏附、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和泡沫細(xì)胞的形成，發(fā)揮促AS的作用[26-27]。環(huán)氧化酶(COX)是前列腺素合成所必需的酶，通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)而誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生發(fā)展[28]。COX-2為重要的環(huán)氧化酶之一，在內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中都有表達(dá)[29]。前期研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB/YY1信號(hào)通路是重要的炎癥相關(guān)通路之一，能夠參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Zhou等[30]發(fā)現(xiàn)，NF-κB、YY1與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(ANRIL)作用可調(diào)控下游炎性因子IL-6、IL-8的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，YY1可結(jié)合到COX-2的啟動(dòng)區(qū)以調(diào)控其表達(dá)[31]。

芍藥苷是活血化瘀中藥芍藥最主要的活性成分之一，具有抗炎、抗AS、抗血栓等作用[32-33]。Jin等[34]發(fā)現(xiàn)芍藥苷可通過(guò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化來(lái)抑制細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。Zhu等[35]在高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)模型中發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過(guò)抑制Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號(hào)通路來(lái)減輕基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。Gu等[36]建立三硝基苯磺酸(TNB-S)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，給予芍藥苷干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可抑制炎性因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α的表達(dá)，該抗炎作用與抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。Zhang等[37]研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌脂蛋白(BLP)誘導(dǎo)單核細(xì)胞系(THP-1)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，芍藥苷可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗炎作用。Guo等[38]通過(guò)用芍藥苷干預(yù)缺血損傷的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過(guò)抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。本研究基于NF-κB/YY1信號(hào)通路觀察芍藥苷對(duì)炎性因子和炎癥介質(zhì)表達(dá)的抑制作用，以闡述芍藥苷可抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的作用，為活血化瘀中藥在臨床的運(yùn)用提供客觀依據(jù)。

本研究通過(guò)構(gòu)建TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs炎癥反應(yīng)和不同劑量芍藥苷對(duì)其干預(yù)效應(yīng)的研究，結(jié)果提示：模型組IL-6、IL-8和COX-2表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，給予不同濃度的芍藥苷干預(yù)后IL-6、IL-8和COX-2表達(dá)降低，其中芍藥苷高劑量組干預(yù)效果更加明顯。研究還發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可抑制NF-κB和YY1表達(dá)，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。提示活血化瘀中藥活性成分芍藥苷呈劑量依賴性降低炎性因子的表達(dá)和炎癥介質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用。

綜上所述，TNF-α可誘導(dǎo)HUVECs的炎癥反應(yīng)，芍藥苷可通過(guò)抑制NF-κB/YY1信號(hào)通路的活化以減少炎性因子IL-6、IL-8的表達(dá)和炎癥介質(zhì)COX-2的活化，進(jìn)而發(fā)揮抗炎、抑制AS進(jìn)展的作用。這可能是活血化瘀中藥治療AS的作用機(jī)制之一。