李媛媛，劉珂依，宋 珂，劉浩琦，安 娜，王麗琴，張涵萊，孫逸坤，朱陵群，邢雁偉，高 穎，高永紅

腦卒中又稱“中風(fēng)”，是全球范圍內(nèi)最主要的威脅人類生命健康的疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的臨床特點(diǎn)[1]。缺血性腦卒中是中風(fēng)最常見的一種疾病類型，約占中風(fēng)病人總數(shù)的87%，主要是由于局部供血障礙導(dǎo)致大腦缺氧性病變和缺血性壞死，進(jìn)而引發(fā)局灶或完全性神經(jīng)功能缺損[2-3]。目前缺血性腦卒中最有效的治療策略是溶栓療法，但由于受時間窗限制且存在出血性轉(zhuǎn)化等影響，臨床使用率相對較低[4-5]。因此，如何預(yù)防缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展，改善腦卒中病人的預(yù)后及生活質(zhì)量，已成為目前臨床關(guān)注的熱點(diǎn)之一。漏蘆為菊科植物祁州漏蘆的干燥根，主要分布于我國華北、東北和西北諸省，具有清熱解毒、消癰下乳、祛瘀通脈之功效[6]。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有關(guān)于漏蘆的記載，“漏蘆，味苦咸寒，久服輕身益氣，耳目聰明，不老延年，列為上品”[7]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，漏蘆具有抗氧化、抗缺氧、抗炎、抗動脈粥樣硬化以及改善記憶障礙等作用[8]，可通過抑制炎癥反應(yīng)，清除氧自由基以及興奮性氨基酸等毒性物質(zhì)，發(fā)揮防治缺血性腦卒中的作用[9]。但漏蘆防治缺血性腦卒中具體作用機(jī)制尚不清楚，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-有效成分-潛在靶點(diǎn)-通路-疾病”的一種復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，進(jìn)一步闡釋漏蘆防治缺血性腦卒中的生物學(xué)機(jī)制，并利用分子對接技術(shù)驗(yàn)證漏蘆有效活性成分與其靶點(diǎn)蛋白的親和性，為深入探討漏蘆防治缺血性腦卒中的分子作用機(jī)制提供了一定的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件 本研究涉及的數(shù)據(jù)庫有TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)，ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/)，Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)，SymMap(https://www.symmap.org/)，CTD(http://ctdbase.org/)，Uniprot(https://www.uniprot.org/)，DisGeNET(https://www.disgenet.org/)，TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)，Drugbank(https://www.drugbank.ca/)，String(https://string-db.org/cgi/input.pl)，Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)，PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，RCSB PDB(https://www.rcsb.org)；軟件有Cytoscape 3.8.0、Auto DockTools 1.5.6、PyMOL 2.4.0、Discovery Studio 4.0、OpenBabel 2.4.1。

1.2 漏蘆活性成分的篩查 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以“漏蘆”為檢索詞，并根據(jù)藥動力學(xué)原理，依據(jù)“口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18”獲取漏蘆有效活性成分。

1.3 有效活性成分作用靶點(diǎn)和疾病潛在靶點(diǎn)的獲取及收集 通過TCMSP、ETCM、Swiss Target Prediction、SymMap、CTD等數(shù)據(jù)庫獲取漏蘆有效活性成分的作用靶點(diǎn)，經(jīng)過整理、校對、去重后，收集漏蘆有效成分相關(guān)的靶蛋白信息。然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將收集到的蛋白靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，篩選出物種條件為人的靶點(diǎn)，即為漏蘆有效成分的潛在靶點(diǎn)。 以“ischemic stroke”為檢索詞，在DisGeNET、TTD、Drugbank數(shù)據(jù)庫中檢索缺血性腦卒中相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，獲得疾病潛在作用靶點(diǎn)。將漏蘆有效成分的潛在靶點(diǎn)與缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集，篩選出二者共同靶點(diǎn)，這些共同的靶標(biāo)蛋白很可能作為漏蘆防治缺血性腦卒中的相關(guān)候選靶點(diǎn)。

1.4 藥物-主要成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述獲得的漏蘆有效成分治療缺血性腦卒中的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，其中外側(cè)節(jié)點(diǎn)顯示的是漏蘆活性成分治療缺血性腦卒中的潛在作用靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)代表的是漏蘆及其主要活性成分。整個網(wǎng)絡(luò)圖直觀地顯示了漏蘆-有效成分-缺血性腦卒中-潛在靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將上述共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置物種為人，獲得蛋白-蛋白之間的相互作用關(guān)系，保存其為TSV格式，然后將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；同時利用“Network Analyzer”插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，并選取自由度值(degree)、介數(shù)(betweenness)和中心度(closeness)均大于中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，確定為漏蘆防治缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析和可視化 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫將上述得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，富集結(jié)果分別采用柱狀圖和氣泡圖的形式進(jìn)行展示。

1.7 漏蘆活性成分與作用靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證 利用AutoDock軟件構(gòu)建漏蘆活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)圖中degree排名前5位的蛋白靶點(diǎn)的分子對接模型，從而驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的可靠性。從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載漏蘆活性成分3D結(jié)構(gòu)的“SDF”格式文件，導(dǎo)入OpenBabel 2.4.1進(jìn)行優(yōu)化；再通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫篩選對應(yīng)蛋白靶點(diǎn)的最佳蛋白晶體結(jié)構(gòu)的“PDB”格式文件。對漏蘆活性成分和重要靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫等處理后，將其轉(zhuǎn)換成pdbqt格式，最后利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接，結(jié)合能越大表明配體與靶點(diǎn)之間的結(jié)合越好。

2 結(jié) 果

2.1 漏蘆活性成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以“漏蘆”為檢索詞，獲得漏蘆活性成分25個，進(jìn)一步以“OB≥30%，DL≥0.18”為篩選閾值，共獲得5種漏蘆的有效活性成分。詳見表1。

表1 漏蘆的有效活性成分及其參數(shù)

2.2 漏蘆防治缺血性腦卒中的潛在作用靶點(diǎn) 通過TCMSP、ETCM、SWISS、SymMap和CTD數(shù)據(jù)庫預(yù)測漏蘆有效成分相關(guān)靶點(diǎn)，去重整理后共獲得相關(guān)靶標(biāo)375個。利用DisGeNET、TTD和Drugbank數(shù)據(jù)庫平臺合并去重后挖掘得到缺血性腦卒中相關(guān)基因1 206個。分別將漏蘆潛在靶點(diǎn)與缺血性腦卒中相關(guān)基因輸入Venny 2.1.0中，繪制韋恩圖，獲得漏蘆防治缺血性

腦卒中相關(guān)候選靶點(diǎn)118個。詳見圖1。

圖1 漏蘆-缺血性腦卒中靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 應(yīng)用Cytoscape軟件繪制藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，其中青色代表缺血性腦卒中(CIS)，黃色代表漏蘆，紫色代表漏蘆的有效活性成分，紅色代表漏蘆-缺血性腦卒中的共同靶點(diǎn)。結(jié)果表明，漏蘆主要通過5種有效活性成分作用于118個靶點(diǎn)，其可能作為漏蘆防治缺血性腦卒中的重要潛在靶標(biāo)。詳見圖2。

圖2 中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將上述漏蘆防治缺血性腦卒中的118個候選靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，得到蛋白之間相互作用關(guān)系，保存為TSV格式文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。詳見圖3。圖中的節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的相互關(guān)系，共涉及111個節(jié)點(diǎn)、1 165條邊(其中MIR122、MIR132、MIR192、MIR223、MIR34A、MIR363未在數(shù)據(jù)庫中找到，PDE3A與其他蛋白不存在相互作用關(guān)系，故均未在網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn))。其中節(jié)點(diǎn)的大小和顏色與degree值成正比，節(jié)點(diǎn)越大對應(yīng)degree值越大，顏色由藍(lán)變紅對應(yīng)的degree值亦逐漸增大。利用Cytoscape中“Network Analyzer”功能從網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的角度進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，獲得度值、介數(shù)和中心度等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?。以中位?shù)為卡值，篩選3項均滿足卡值的靶點(diǎn)為漏蘆防治缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，共獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)44個。詳見表2。

圖3 中藥-疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 漏蘆防治缺血性腦卒中關(guān)鍵候選靶點(diǎn)

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析及可視化 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫對上述關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，按照顯著度P<0.05共確定了272個條目。其中細(xì)胞生物過程富集的基因數(shù)相對較多，共207個條目，排名比較靠前的有一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、凋亡的負(fù)向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及衰老過程等，表明漏蘆可能主要通過調(diào)節(jié)以上多條生物過程發(fā)揮治療缺血性腦卒中的作用。與細(xì)胞組成相關(guān)的條目共30個，富集結(jié)果主要集中在細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜、高爾基體、溶酶體等。涉及分子功能的靶點(diǎn)條目共35個，主要包括酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、類固醇激素受體活性、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。根據(jù)Count值排序，分別取前10名進(jìn)行分析。詳見圖4。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對漏蘆防治缺血性腦卒中相關(guān)的44個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)P<0.05篩選獲得76條相關(guān)信號通路，經(jīng)查文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)與缺血性腦卒中密切相關(guān)的信號通路有3條，分別是腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路。根據(jù)P值從小到大排序選取前20條信號通路進(jìn)行可視化處理(富集程度可根據(jù)P值和基因個數(shù)進(jìn)行衡量)。詳見圖5。

圖4 漏蘆防治缺血性腦卒中關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析

圖5 漏蘆關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG富集通路氣泡圖

2.6 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述所得到的漏蘆及其有效活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、信號通路和缺血性腦卒中同時導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(見圖6)。其中紅色節(jié)點(diǎn)代表漏蘆，紫色節(jié)點(diǎn)代表漏蘆有效活性成分，青色節(jié)點(diǎn)代表漏蘆防治缺血性腦卒中潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)，粉色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)相關(guān)KEGG通路，黃色節(jié)點(diǎn)代表缺血性腦卒中。由圖6可知，漏蘆可通過5種不同的活性成分作用于不同的靶點(diǎn)，包括白蛋白(ALB)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、TNF、半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)及絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等；此外不同的靶點(diǎn)亦可通過多條通路發(fā)揮抗缺血性腦卒中的作用機(jī)制，涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、TLR信號通路等。該網(wǎng)絡(luò)圖充分體現(xiàn)了中藥漏蘆具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮防治缺血性腦卒中的臨床特征，作用機(jī)制復(fù)雜多樣。

圖6 漏蘆-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病多維網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 漏蘆主要活性成分與對應(yīng)核心靶點(diǎn)蛋白的分子對接驗(yàn)證 利用AutoDock軟件將甘草素、β-谷甾醇、谷甾醇、甘草苷等5種化合物與ALB、IL-6、TNF、CASP3及MAPK1等相對應(yīng)的核心靶點(diǎn)分別建立分子對接模型(見圖7)。對接結(jié)果只保留每對分子對接Affinity(kcal/mol)絕對值最高的。一般認(rèn)為，結(jié)合能大于5 kcal/mol表明化合物與靶點(diǎn)蛋白之間結(jié)合活性較好；結(jié)合能大于7.0 kcal/mol表明小分子與受體蛋白具有很強(qiáng)的結(jié)合活性。熱圖結(jié)果顯示，除了甘草素與MAPK1的對接打分小于7.0 kcal/mol之外，其他化合物與對應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)合能均大于7.0 kcal/mol，說明漏蘆有效活性成分與ALB、IL-6、TNF、CASP3及MAPK1共5種核心靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合活性。綜合上述結(jié)果，表明甘草素、β-谷甾醇、谷甾醇、甘草苷和黃獨(dú)素B與潛在核心靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，表明漏蘆可能通過作用于潛在核心靶點(diǎn)發(fā)揮防治缺血性腦卒中的作用。同時借助Pymol 2.4.0軟件分別對β-谷甾醇與ALB、β-谷甾醇與IL-6、黃獨(dú)素B與ALB以及黃獨(dú)素B與IL-6進(jìn)行分子對接可視化。詳見圖8。

圖7 分子對接分?jǐn)?shù)的熱圖分析

圖8 分子對接模式圖

3 討 論

缺血性腦卒中是以偏癱、失語等局灶性神經(jīng)功能缺損為特征的一種疾病，發(fā)病迅速、病情復(fù)雜、變化多端且預(yù)后相對較差。其中瘀血作為缺血性腦卒中的主要病理產(chǎn)物和致病因素，貫穿疾病的始終，成為疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[10]。漏蘆，性寒，味苦微咸，入胃及大腸經(jīng)，為解毒通絡(luò)之良藥。臨床研究發(fā)現(xiàn)，漏蘆可配伍不同藥味共奏活血通絡(luò)，清除腦中瘀毒之功，如腦栓通膠囊、復(fù)方蓯蓉益智膠囊等中成藥[11-12]。雖然漏蘆可以改善缺血后腦損傷反應(yīng)，但是其作用機(jī)制尚不明確。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為漏蘆防治缺血性腦卒中的分子機(jī)制研究提供了參考。

本研究以TCMSP數(shù)據(jù)庫中OB、DL為參數(shù)，共獲得5種漏蘆的有效活性成分，分別是甘草素、β-谷甾醇、谷甾醇、甘草苷和黃獨(dú)素B。藥理研究表明，甘草素具有抗氧化、抗炎和抗病毒等多種生物活性，可顯著上調(diào)雌激素受體β基因(ERβ)的表達(dá)而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，抑制NOD樣受體家族3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶 -1(Caspase-1)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的釋放，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)[13-14]。β-谷甾醇具有血管生成的作用，可以有效恢復(fù)缺血/再灌注損傷沙鼠的運(yùn)動功能[15]。甘草苷作為小鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的潛在治療藥物，其可能是通過抗氧化以及抗凋亡的藥理特性發(fā)揮缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。上述已有文獻(xiàn)報道為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了一定的理論基礎(chǔ)，即甘草素、β-谷甾醇和甘草苷可作為漏蘆防治缺血性腦卒中的關(guān)鍵有效活性成分。此外，文獻(xiàn)中關(guān)于谷甾醇和黃獨(dú)素B在腦缺血方面的研究相對較少，可作為以后實(shí)驗(yàn)研究的新視角。

通過中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖和PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，ALB、IL-6、TNF、CASP3及MAPK1等可能是漏蘆防治缺血性腦卒中的核心靶點(diǎn)。其中ALB是血液系統(tǒng)中的重要組成成分，在抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血管滲透性及抗凝血功能等方面發(fā)揮著重要的生理功能[16]。此外，ALB具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)功能，在人體的免疫系統(tǒng)中亦發(fā)揮著十分重要的作用[17-18]，其可能與腦卒中的預(yù)后關(guān)系較為密切。炎癥是缺血性腦卒中的病理標(biāo)志，TNF、IL-6作為強(qiáng)有力的炎性細(xì)胞因子，是未來中風(fēng)治療的潛在靶點(diǎn)。最近有研究表明，卒中后IL-6的釋放可通過激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體以及內(nèi)皮素-1(ET-1)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的上調(diào)導(dǎo)致腦卒中后腦脊液和腦組織釋放，進(jìn)而損害腦血管的自動調(diào)節(jié)并促進(jìn)海馬神經(jīng)壞死[19]。TNF是通過激活單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子[20]，可以通過激活膠質(zhì)細(xì)胞并介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的浸潤，在缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[21]。CASP3作為Caspase家族中備受關(guān)注的蛋白之一，可催化多種細(xì)胞關(guān)鍵蛋白的特異性斷裂，是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶[22]，在啟動缺血腦區(qū)受損神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中發(fā)揮著十分重要的作用[23-25]。目前，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)已被廣泛研究，在缺血性腦中后調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)中起著關(guān)鍵作用[26]。MAPK1作為生化信號的整合點(diǎn)，在多種細(xì)胞生物過程，包括細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和發(fā)育等方面均發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用[27]。

KEGG富集通路結(jié)果表明，漏蘆的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于以下幾條相關(guān)通路，包括TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路等途徑。其中TNF信號通路是參與中風(fēng)后炎癥反應(yīng)及血腦屏障破壞的重要信號通路之一[28-30]。腦缺血發(fā)生后，缺血神經(jīng)元會釋放大量炎性細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α等)，從而誘發(fā)更多的炎性細(xì)胞因子及細(xì)胞毒素物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)一步破壞血腦屏障和細(xì)胞外基質(zhì)，加速繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生[31]。HIF-1信號通路是缺血后促進(jìn)血管再生以及維持血腦屏障完整性的關(guān)鍵通路之一，其中低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)作為血管內(nèi)皮生長因子的上游調(diào)節(jié)劑，是腦損傷應(yīng)答的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)血管的生成、細(xì)胞的凋亡與自噬等多條信號通路[32-33]。此外，TLR信號通路在腦缺血引起的神經(jīng)損傷過程中也起著重要的作用。輕度缺血性腦損傷可通過抑制Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)和Toll樣受體2(TLR2)信號通路以及激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)信號通路從而導(dǎo)致TLR缺血耐受并減少腦損傷；反之，急性缺血性腦卒中亦可激活TLR信號通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的釋放，并引發(fā)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此，推測漏蘆有效成分可能是通過TNF信號通路、HIF-1信號通路、TLR信號通路等途徑調(diào)控ALB、IL-6、TNF、CASP3、MAPK1等核心靶點(diǎn)防治缺血性腦卒中。分子對接結(jié)果亦表明，甘草素、β-谷甾醇、谷甾醇、甘草苷和黃獨(dú)素B與ALB、IL-6、TNF、CASP3、MAPK1等相對應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合能均大于7 kcal/mol，提示兩者之間均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，提示其很有可能是防治缺血性腦卒中的關(guān)鍵活性成分及核心靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測漏蘆防治缺血性腦卒中的分子機(jī)制，結(jié)果表明，漏蘆有效活性成分可能通過TNF信號通路，HIF-1信號通路，TLR信號通路等途徑調(diào)控ALB、IL-6、TNF、CASP3、MAPK1等核心靶點(diǎn)防治缺血性腦卒中；同時采用分子對接技術(shù)證實(shí)了漏蘆有效活性成分與其相關(guān)靶點(diǎn)均能夠最佳結(jié)合，提示漏蘆通過“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的方式防治缺血性腦卒中，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)血管新生和神經(jīng)功能恢復(fù)等效應(yīng)。然而本研究僅在理論水平上初步預(yù)測了漏蘆防治缺血性腦卒中的分子機(jī)制，旨在為深入挖掘漏蘆-靶點(diǎn)-通路之間的相互關(guān)系提供新思路，為進(jìn)一步開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。