劉甜甜，陳恒文，姚魁武

冠心病是冠狀動(dòng)脈血氧供應(yīng)減少或中斷，臨床可見心絞痛、心肌梗死、心肌缺血或猝死的心血管事件[1-2]。冠心病屬中醫(yī)“胸痹”“心痛”“心悸”“厥心痛”“真心痛”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為胸痹、心痛多因陽氣虧虛、寒邪凝滯、痰濁內(nèi)蘊(yùn)、瘀血留停導(dǎo)致血脈瘀滯。通心舒膠囊是臨床治療冠心病心絞痛的常用藥，由川芎、丹參提取物及沙棘提取物組成，方中川芎和丹參能活血化瘀、行氣止痛；沙棘健脾養(yǎng)胃、活血散瘀；全方共奏益氣活血、散瘀止痛之功效。通心舒膠囊對氣虛血瘀型冠心病具有明顯療效。目前關(guān)于通心舒膠囊對冠心病療效的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究旨在借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討通心舒膠囊治療冠心病的分子機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 通心舒膠囊活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)(TCMSP)搜索通心舒膠囊(川芎、丹參、沙棘)活性成分，依據(jù)口服生物利用度(DB)>30%且類藥性(DL)>0.18篩選通心舒膠囊中的有效成分，并檢索其作用靶點(diǎn)，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫和STRING數(shù)據(jù)庫找到靶點(diǎn)蛋白相應(yīng)的基因名稱。

1.2 通心舒膠囊-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的化合物和靶點(diǎn)基因輸入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建通心舒膠囊化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)[3]，并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。網(wǎng)絡(luò)中的“節(jié)點(diǎn)”代表通心舒膠囊活性成分和靶基因，“邊”表示通心舒膠囊活性成分與靶基因之間的關(guān)系。

1.3 通心舒膠囊-疾病靶基因蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞“冠心病”，檢索冠心病相關(guān)靶基因。利用Venny 2.1.0軟件繪制通心舒膠囊活性成分與冠心病相交靶標(biāo)的韋恩圖。將篩選得到的作用靶基因錄入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，得到的數(shù)據(jù)以TSV.格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建通心舒膠囊活性成分與冠心病靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)，并對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，選擇自由度(degree)和介數(shù)中心性(betweenness centrality)都大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 基因富集分析 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對通心舒膠囊活性成分與冠心病PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，依據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率Benjamini<0.05篩選具有顯著性差異的生物過程、分子功能及KEGG通路，繪制信號通路高級氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 通心舒膠囊活性化合物 依據(jù)OB、DL及活性成分含量，排除重復(fù)化合物和沒有作用靶點(diǎn)的成分，篩選出通心舒膠囊有效化合物88個(gè)，其中川芎7個(gè)，丹參59個(gè)，沙棘22個(gè)，獲得相應(yīng)作用靶點(diǎn)253個(gè)，通心舒膠囊活性成分基本信息見表1。

表1 通心舒膠囊主要活性化合物

(續(xù)表)

(續(xù)表)

2.2 通心舒膠囊活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.7.2軟件將通心舒膠囊中川芎、丹參、沙棘活性物質(zhì)分別與作用靶點(diǎn)構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，川芎化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中有41個(gè)節(jié)點(diǎn)和92條邊，degree值最高的前4個(gè)化合物是楊梅酮、川芎哚、川芎萘呋內(nèi)酯、川芎嗪。詳見圖1。丹參化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中有196個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 864條邊，degree值最高的前21個(gè)化合物包括木犀草素、1，2，5，6-四氫丹參酮、去氫龍膽素ⅡA、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、4-亞甲丹參新酮、亞甲基丹參醌、吡喹酮c、隱丹參酮、丹參新醌D、丹參螺縮酮內(nèi)脂、脫氧隱丹參酮、二氫丹參內(nèi)酯、表丹參螺縮酮內(nèi)脂、異隱丹參酮、異丹參酮Ⅱ、丹參醌酚Ⅰ、丹參新酮、新隱丹參酮Ⅱ、1-甲基-8，9-二氫-7H-萘[5，6-g]苯并呋喃-6，10，11-三酮、丹參酮、丹參酮ⅡA。詳見圖2。沙棘化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中有243個(gè)節(jié)點(diǎn)和1014條邊，degree值最高的前12個(gè)化合物依次為槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、兒茶素、天竺葵素、β-胡蘿卜素、5，7-二羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)鉻-4-酮、黃酮、黃酮醇、(2S)-黃烷酮。詳見圖3。以上37個(gè)degree值較高的化合物可能是通心舒膠囊治療冠心病的關(guān)鍵活性成分。

圖1 川芎化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2 丹參化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 沙棘化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 通心舒膠囊與冠心病靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將253個(gè)通心舒膠囊活性成分作用靶點(diǎn)與912個(gè)冠心病靶點(diǎn)錄入在線Venny 2.1.0軟件繪制韋恩圖(見圖4)，兩者取交集后獲得通心舒膠囊活性成分-冠心病作用靶點(diǎn)90個(gè)，將這90個(gè)靶基因錄入STRING數(shù)據(jù)庫，得到蛋白基因互作信息，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，得到通心舒膠囊對冠心病作用靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖5)，網(wǎng)絡(luò)包括81個(gè)節(jié)點(diǎn)、466條邊。由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析可知，網(wǎng)絡(luò)集聚系數(shù)為0.359，網(wǎng)絡(luò)中心性為0.183，網(wǎng)絡(luò)密度為0.072，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為0.759，最短路徑為6 164(95%)。節(jié)點(diǎn)自由度值和介數(shù)中心性是描述網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的重要指標(biāo)。圖5中平均節(jié)點(diǎn)的degree值為5.753，平均介數(shù)中心性為0.025，大于平均degree值的節(jié)點(diǎn)有33個(gè)，圖中黃色橢圓形節(jié)點(diǎn)表示大于平均degree值的蛋白基因。節(jié)點(diǎn)大于平均介數(shù)中心性的節(jié)點(diǎn)有26個(gè)，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的degree值和介數(shù)中心性篩選出18個(gè)核心作用靶點(diǎn)，分別為視黃醇X受體α(RXRA)、蛋白激酶B1(AKT1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、白細(xì)胞介素-6(IL6)、原癌基因c-Fos(FOS)、表皮生長因子受體(EGFR)、腫瘤抑制因子P53(TP53)、趨化因子8(CXCL8)、內(nèi)皮素1(EDN1)、前列環(huán)素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(PTGS2)、白蛋白(ALB)、整合素B3(ITGB3)、白細(xì)胞介素-4(IL4)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(SERPINE1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)、糖皮質(zhì)激素受體基因(NR3C1)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)。這些核心靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，可能是通心舒膠囊治療冠心病的潛在靶點(diǎn)。

圖4 通心舒膠囊與冠心病交叉靶基因韋恩圖

圖5 通心舒膠囊-冠心病PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO生物功能和KEGG通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫分析出通心舒膠囊治療冠心病的生物過程438個(gè)，分子功能83個(gè)。依據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率Benjamini<0.05篩選出158個(gè)生物過程和38個(gè)分子功能。對生物過程中富集基因數(shù)≥10的前25項(xiàng)作圖，涉及的主要生物過程包括調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、凋亡過程、炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、血管新生、調(diào)節(jié)一氧化氮生物合成等。詳見圖6。參與的分子功能主要有蛋白酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白激酶結(jié)合、生長因子活性等。詳見圖7。對KEGG通路富集分析，依據(jù)Benjamini<0.05及排除廣泛共性通路后，篩選出通心舒膠囊治療冠心病相關(guān)的信號通路20個(gè)，繪制氣泡圖。詳見圖8。

圖6 通心舒膠囊-冠心病生物過程

圖7 通心舒膠囊-冠心病分子功能

圖8 通心舒膠囊-冠心病交叉基因的信號通路

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，采用高通量數(shù)據(jù)庫平臺(tái)及Cytoscape軟件，構(gòu)建通心舒膠囊與冠心病PPI網(wǎng)絡(luò)，并對靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能和信號通路富集分析，比較系統(tǒng)地探討通心舒膠囊治療冠心病的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，通心舒膠囊治療冠心病的關(guān)鍵化合物有川芎嗪、木犀草素、丹參酮、異丹參酮、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、β-胡蘿卜素、黃酮、黃酮醇等。研究證實(shí)川芎嗪、丹參酮、槲皮素、沙棘黃酮等均有改善心肌缺血的功效[4-7]。說明通心舒膠囊治療冠心病是多種活性成分共同作用的結(jié)果。信號通路富集結(jié)果提示通心舒膠囊通過作用于多條信號通路治療冠心病，并且這些通路多數(shù)被證實(shí)與冠心病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、叉頭框O(FoxO)、核因子-κB(NF-κB)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Janus激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)等信號通路都參與缺血心肌損傷及凋亡過程[8-14]。本研究表明通心舒膠囊通過作用于腫瘤壞死因子(TNF)和NF-κB信號通路，抑制炎癥反應(yīng)，減輕氧化損傷；通過活化鈣信號通路，提升胞內(nèi)鈣離子濃度；通過激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、PI3K/AKT通路，保護(hù)血管內(nèi)皮，促進(jìn)血管新生；以及通過作用于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和mTOR信號通路，抑制心肌凋亡，從而改善心肌缺血狀態(tài)，促進(jìn)心功能恢復(fù)，達(dá)到治療冠心病目的。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步闡明了通心舒膠囊的作用機(jī)制，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床用藥指明了方向。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)模型上，雖然能解釋中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的關(guān)系，但是網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計(jì)的一些小分子化合物及作用靶點(diǎn)信息存在一定的局限性、篩選活性成分的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，因此，其結(jié)果的準(zhǔn)確性還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。