周鵑#王志偉#馮晶*夏平趙曉龍汪朋李艷麗陳永杰

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）引起的下腰痛在現(xiàn)代社會(huì)中非常普遍，造成了嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)和患者生活質(zhì)量的下降。研究表明，髓核是椎間盤行使功能的中心和最早發(fā)生退變的部位，髓核細(xì)胞退變及其導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)成分改變是椎間盤退變?cè)缙谧钪匾牟±硖卣鱗1]。遺傳、年齡、體重、過度壓力、炎癥刺激等是椎間盤退變的主要病因[2]。在過度壓力條件下，髓核細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝減少，分解代謝增加，從而導(dǎo)致椎間盤退變[3]。近年來，研究表明壓力因素通過表觀遺傳學(xué)修飾的途徑影響著IDD的發(fā)生，但其如何調(diào)控椎間盤退變的機(jī)制卻鮮有報(bào)道[4]。表觀遺傳學(xué)修飾是指細(xì)胞DNA序列未發(fā)生改變，但基因的功能發(fā)生可逆、可遺傳的改變[5-6]。本研究探討表觀遺傳修飾改變對(duì)過度壓力介導(dǎo)的IDD進(jìn)程的影響，為IDD的臨床治療和疾病預(yù)防提供思路和理論實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 獲取正常與退變椎間盤標(biāo)本

對(duì)武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2018年1月至2019年6月采用脊柱外科手術(shù)的患者術(shù)前進(jìn)行椎間盤退變進(jìn)行Pfirrmann分級(jí)，并在手術(shù)中收集了4例脊柱側(cè)彎患者正常的髓核組織及4例腰椎間盤突出癥患者退變的髓核組織。所有標(biāo)本均在離體30 min內(nèi)提取髓核細(xì)胞。該研究已獲本院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào):[2017]9），所有患者知情同意并簽署臨床研究知情同意書。

1.2 主要藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的5-氮雜胞苷（Selleck公司，上海），Angiopoietin 2抗體、兔多克隆抗體Tie-2以及Aggrecan抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，武漢），兔多克隆抗體CollagenⅡ抗體和SOX-9抗體（Abcam公司，英國(guó)），兔多克隆抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司，杭州），正常山羊血清和熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，武漢），細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）。

1.3 髓核細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

獲取的髓核組織清洗，將髓核組織剪成小碎塊，用0.1%Ⅱ型膠原酶消化6～8 h，離心后收集沉淀、過濾，收集懸液后再次1 000 rpm×5 min離心。以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)，置于含5%CO2的培養(yǎng)箱中，7 d后首次更換培養(yǎng)液，以后每周更換培養(yǎng)液2次。在倒置相差顯微鏡下觀察原代髓核細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合90%時(shí)傳代培養(yǎng)。取P=1代進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[7]。

1.4 髓核細(xì)胞的分組處理

此實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第一部分分為4組:取生長(zhǎng)情況良好的正常髓核細(xì)胞分為兩組，將兩組細(xì)胞放入適宜溫度和CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后將第1組細(xì)胞放入壓力設(shè)置為0 MPa的培養(yǎng)箱中（正?？瞻捉M），第2組細(xì)胞放入壓力為1 MPa、其余條件相同的培養(yǎng)箱中（正常壓力組）;同樣的方法選取退變的髓核細(xì)胞分為兩組:第3組為0 MPa壓力環(huán)境（退變空白組），第4組為1 MPa壓力環(huán)境（退變壓力組），兩組其余培養(yǎng)條件都相同。24 h后對(duì)4組髓核細(xì)胞分別進(jìn)行RT-PCR、Western Blot和細(xì)胞活力等檢測(cè)。第二部分分為3組:取生長(zhǎng)情況良好的正常髓核細(xì)胞分為3組，將3組放入適宜溫度和CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。后將第1組細(xì)胞放入壓力為0 MPa的培養(yǎng)箱中（空白組）;第2組細(xì)胞放入壓力為1 MPa、其余條件相同的培養(yǎng)箱中（壓力組）;第3組細(xì)胞放入壓力為1 MPa、其余條件相同的培養(yǎng)箱中，加入10 mol/L濃度5-氮雜胞苷處理（5-氮雜胞苷組）。24 h后，再次進(jìn)行上述相關(guān)檢測(cè)。具體流程見圖1。

圖1 Ang-2表觀遺傳學(xué)修飾在壓力介導(dǎo)的椎間盤退變中的作用機(jī)制

1.5 RT-PCR

用Trizol試劑（Ambion）分解髓核細(xì)胞后分離提取總RNA，計(jì)算RNA濃度，隨后用DL2000 DNA Marker（TIANGEN）將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)4組細(xì)胞中Ang-2、Tie-2、Aggrecan、CollagenⅡ和SOX-9表達(dá)量。繪制上述各靶基因轉(zhuǎn)錄RNA的溶解曲線圖，以2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各引物序列表見表1。

表1 引物序列表

1.6 Western Blot檢測(cè)

獲取各組髓核細(xì)胞的總蛋白后測(cè)定其濃度，然后將提取的蛋白放入100℃沸水浴中變性。制備好電泳膠，取40 g蛋白，進(jìn)行電泳分離。1 h后將蛋白轉(zhuǎn)膜、浸泡，在25℃室溫條件下?lián)u床封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗:GAPDH（1∶1 000）;SOX-9（1∶1 000）;Aggrecan（1∶600）;Ang-2（1∶1000）;CollagenII（1∶1000）;Tie-2（1∶500），浸泡12h。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)識(shí)的山羊抗兔的二抗，孵育2 h后暗室曝光，最后采用BandScan法分析膠片灰度值。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將各組髓核細(xì)胞爬片良好的玻片用PBS浸泡清洗，收集髓核細(xì)胞。用4%的多聚甲醛固定爬片。0.5%Triton X-100（PBS配制）（碧云天，上海）室溫通透。加入正常血清后封閉，吸掉封閉液后滴加一抗Collagen II（1∶50稀釋）、Aggrecan（1∶50稀釋），放入濕盒，4℃孵育過夜。爬片使用PBS溶液浸洗后加入熒光二抗熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶100稀釋比例），在37℃溫度條件下的濕盒中孵育1 h。加入40，6-二氨基-2-苯基吲哚DAPI（碧云天，中國(guó)上海)避光孵育，對(duì)髓核細(xì)胞進(jìn)行染核，染核后封片，最后通過熒光顯微鏡來收集細(xì)胞圖像。

1.8 MTT法檢測(cè)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，培養(yǎng)置DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）中，當(dāng)達(dá)到1×105/mL密度后以100 L/孔的密度將混液加入96孔培養(yǎng)板中，在含有細(xì)胞孔附近的孔中滴入等量的PBS溶液，放入36℃過夜，當(dāng)達(dá)到培養(yǎng)所需時(shí)間后，每孔滴入10 L MTT（BIOSHARP，武漢），37℃溫度條件下培養(yǎng)3～4 h。采用酶標(biāo)儀568 nm檢測(cè)各個(gè)培養(yǎng)孔的吸光值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)都采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。本研究使用Graphpad Prism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。本研究采用單因素方差分析和兩兩比較分析方法<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 壓力刺激對(duì)髓核細(xì)胞Ang-2/Tie-2信號(hào)通路及細(xì)胞外基質(zhì)的影響

筆者分別將正常和退變兩種髓核細(xì)胞中的各1組放置于1 MPa壓力的環(huán)境中，培育24 h后，分別檢測(cè)4組髓核細(xì)胞中Ang-2的表達(dá)情況。結(jié)果表明，壓力刺激使髓核細(xì)胞中Ang-2的表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）（見圖2A、圖2F）。另外用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)4組細(xì)胞中Tie-2、CollagenⅡ、SOX-9和Aggrecan的轉(zhuǎn)錄和翻譯。結(jié)果表明，壓力刺激的髓核細(xì)胞中Tie-2的轉(zhuǎn)錄和翻譯明顯增加（見圖2B、圖2G），CollagenⅡ、SOX-9和Aggrecan的轉(zhuǎn)錄和翻譯明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2C-E、圖2H-J）。隨后對(duì)上述4組細(xì)胞中的CollagenⅡ和Aggrecan進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果表明壓力刺激抑制兩者的表達(dá)（見圖2K、圖2L）。

2.2 DNA甲基化抑制劑對(duì)Ang-2/Tie-2信號(hào)通路的影響

將空白組、壓力組及5-氮雜胞苷組3組髓核細(xì)胞的RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行RT-PCR和Western Blot檢測(cè)。結(jié)果表明，DNA甲基化抑制劑減少了壓力誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞中Ang-2和Tie-2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05，見圖3）。

2.3 DNA甲基化抑制劑對(duì)髓核細(xì)胞活力及細(xì)胞外基質(zhì)的影響

用MTT法檢測(cè)上述3組髓核細(xì)胞的活力及免疫熒光法測(cè)定CollagenⅡ、Aggrecan的表達(dá)情況。結(jié)果表明，壓力的刺激使髓核細(xì)胞活力下降，細(xì)胞外基質(zhì)（CollagenⅡ、Aggrecan）表達(dá)量減少;而DNA甲基化抑制劑可提高髓核細(xì)胞的活力及抑制壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05，見圖4）。

圖2 A-E.4組細(xì)胞Ang-2、Tie-2、CollagenⅡ、SOX-9、Aggrecan mRNA相對(duì)表達(dá)量;F-J.4組細(xì)胞Ang-2、Tie-2、CollagenⅡ、SOX-9、Aggrecan蛋白的Western Blot蛋白條帶圖及蛋白印跡灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH的比值;K.4組細(xì)胞CollagenⅡ表達(dá)熒光圖及相對(duì)熒光強(qiáng)度柱狀圖;L.4組細(xì)胞Aggrecan表達(dá)熒光圖及相對(duì)熒光強(qiáng)度柱狀圖

圖3 A.3組細(xì)胞Ang-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量;B.3組細(xì)胞Tie-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量;C.3組細(xì)胞Ang-2蛋白的Western Blot蛋白條帶圖及蛋白印跡灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH的比值;D.3組細(xì)胞Tie-2蛋白的Western Blot蛋白條帶圖及蛋白印跡灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH的比值

圖4 A.3組細(xì)胞CollagenⅡ表達(dá)熒光圖及相對(duì)熒光強(qiáng)度柱狀圖;B.3組細(xì)胞Aggrecan表達(dá)熒光圖及相對(duì)熒光強(qiáng)度柱狀圖;C.3組細(xì)胞OD值

3 討論

椎間盤退變（IDD）是一種以髓核細(xì)胞發(fā)生退變表型和細(xì)胞外基質(zhì)降解為特征的退行性疾病。IDD的病因主要包括過度壓力、心血管疾病、感染等一系列環(huán)境和基因因素[8]。研究發(fā)現(xiàn)，適度壓力對(duì)椎間盤具有保護(hù)作用，但是過度壓力則會(huì)使髓核細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)減少，進(jìn)而加劇椎間盤細(xì)胞死亡[9]。本研究結(jié)果表明，壓力刺激調(diào)控髓核細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)靶基因（CollagenⅡ、SOX-9和Aggrecan）的表達(dá)，抑制髓核細(xì)胞活性。因此，過度壓力在IDD發(fā)展過程中扮演重要角色，延緩過度壓力對(duì)髓核細(xì)胞的影響在IDD的防治中具有重要意義。

Ang-2是一種作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌型細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，能識(shí)別并抑制其特異性酪氨酸激酶受體（Tie-2）激活，在血管發(fā)育、重構(gòu)過程起重要作用[10-11]。前期研究表明，退變髓核細(xì)胞中Ang-2表達(dá)和釋放增加，通過介導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解推動(dòng)IDD進(jìn)程[12-13]。然而，調(diào)控Ang-2表達(dá)的因素，以及減少Ang-2的表達(dá)對(duì)過度壓力導(dǎo)致的IDD的影響需進(jìn)一步研究。

表觀遺傳學(xué)調(diào)控是指不改變基因的核苷酸序列的前提下使基因功能發(fā)生改變，對(duì)個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育疾病等過程產(chǎn)生影響[5-6]。DNA甲基化抑制劑通過影響環(huán)境因素，從而在不損害基因組完整性的前提下，對(duì)基因組信息作出適當(dāng)修飾，以適應(yīng)環(huán)境變化[14]。已有學(xué)者研究表明，基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)改變可以顯著影響Ang-2基因表達(dá)程度，在一系列惡性腫瘤和退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用，甚至能成為疾病程度和預(yù)后的判斷指標(biāo)[15]。然而，Ang-2表觀遺傳修飾狀態(tài)的改變?cè)贗DD進(jìn)程中的作用仍未見報(bào)道。本研究結(jié)果首次表明壓力刺激明顯增加了Ang-2和Tie-2的表達(dá)，然而DNA甲基化抑制劑通過抑制Ang-2、Tie-2的表達(dá)延緩壓力誘導(dǎo)的CollagenⅡ、Aggrecan減少及髓核細(xì)胞活性下降。因此，以過度壓力為特征的髓核細(xì)胞外環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致了Ang-2基因表觀遺傳修飾狀態(tài)改變，進(jìn)而發(fā)生過度表達(dá)，Ang-2/Tie-2信號(hào)通路過度激活使髓核細(xì)胞的活力降低以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解，最終導(dǎo)致IDD。本實(shí)驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上首次探討調(diào)控Ang-2表觀遺傳修飾對(duì)IDD進(jìn)程的影響，可為IDD的臨床治療和疾病預(yù)防提供新的思路及理論實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)研究只是初步探討了DNA甲基化抑制劑對(duì)Ang-2/Tie-2信號(hào)通路的影響，未進(jìn)行靶向干預(yù)研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可靶向調(diào)控Ang-2/Tie-2信號(hào)通路，進(jìn)一步研究表觀遺傳修飾對(duì)壓力誘導(dǎo)椎間盤退變的影響。