呂呈蔚，李倬林，李鐵柱，黃 威

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長(zhǎng)春 130033）

有機(jī)磷農(nóng)藥（OPPs） 是指在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的含磷有機(jī)化合物農(nóng)藥，主要用作殺蟲(chóng)劑，少數(shù)用作除草劑、殺菌劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[1]。在控制農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害和提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)量方面發(fā)揮了積極作用。有機(jī)磷農(nóng)藥按結(jié)構(gòu)分為五大類，即磷酸酯類、硫代臨酸酯類、磷酸胺類、焦磷酸酯類和磷酸酯類。多數(shù)呈油狀或白色晶狀粉末，在中性和酸性條件下穩(wěn)定，不易水解。我國(guó)常用的有機(jī)磷農(nóng)藥主要有對(duì)硫磷（Parathion）、內(nèi)吸磷（Demeton）、甲拌磷（Phorate）、敵敵畏（Dichlorvos）、甲基對(duì)硫磷（Parathion-methyl）、甲基內(nèi)吸磷（Demeton-methyl）、敵百蟲(chóng)（Dipterex）、樂(lè)果（Dimethoate）、馬拉硫磷（Malathion）、殺螟硫磷（Fenitrothion）、毒死蜱（Chlorpyrifos） 等。綜述了有機(jī)磷農(nóng)藥的危害和常用檢測(cè)技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，為后續(xù)開(kāi)發(fā)高效、快速和高靈敏度的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法提供參考。

1 有機(jī)磷農(nóng)藥的危害

有機(jī)磷農(nóng)藥因其廣譜、高效、快速、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，而被世界各國(guó)農(nóng)民廣泛應(yīng)用。長(zhǎng)期大量濫用有機(jī)磷農(nóng)藥，使得農(nóng)藥殘留問(wèn)題日益嚴(yán)重。有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留不僅污染生態(tài)環(huán)境，在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留更是對(duì)人類健康和生命安全造成不同程度的危害[2]。OPPs 的毒性是基于對(duì)人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的抑制，而乙酰膽堿酯酶對(duì)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能至關(guān)重要。大量攝入OPPs 會(huì)出現(xiàn)一系列神經(jīng)中毒癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)呼吸麻痹，甚至死亡。長(zhǎng)期接觸或通過(guò)飲食攝入低劑量的OPPs，會(huì)出現(xiàn)臟器損傷、致畸、致癌、致突變等[3]。世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，每年約有20 萬(wàn)人因直接或間接接觸有機(jī)磷農(nóng)藥導(dǎo)致中毒[4]?？紤]到大量使用有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境具有較大的危害性，我國(guó)發(fā)布了GB 23200.93—2016《食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測(cè)定》，規(guī)定了食品中有機(jī)磷類農(nóng)藥的最大允許殘留量為0.2 mg/kg。然而，從近幾年的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的情況不容樂(lè)觀。因此，構(gòu)建一種高效、快速、靈敏度高的檢測(cè)方法，對(duì)人類和環(huán)境具有重要意義。

2 檢測(cè)技術(shù)研究現(xiàn)狀

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS） 是利用氣相色譜作為進(jìn)樣系統(tǒng)，利用質(zhì)譜作為監(jiān)測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析，能夠把分子轉(zhuǎn)化生成帶電離子，并在氣態(tài)中根據(jù)質(zhì)荷比（m/z） 的不同將離子分離并檢測(cè)。GC-MS 因其高功能及高靈敏度而成為較常用的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。但GC-MS 操作復(fù)雜、檢測(cè)成本高、儀器昂貴，以及需要具有一定專業(yè)技術(shù)水平的人員才能操作等缺點(diǎn)，故不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。崔如玉等人[5]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)蔬菜、谷物中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。乙腈作為提取劑，采用DB-35ms 型色譜柱進(jìn)行分離，在多反應(yīng)檢測(cè)儀下檢測(cè)16 種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。結(jié)果顯示，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.94。所測(cè)樣品中16 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率分別為大米75.9%～112.2%，面粉77.3%～126.9%，蔬菜76.2%～125.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） ≤8.5%。馬妍等人[6]采用固相萃取-分散液液微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定中草藥類保健食品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。用含0.5%甲酸的乙腈作為提取劑，經(jīng)分散固相萃取管（d-SPE） 凈化后，采用分散液液微萃取，用氯仿濃縮目標(biāo)物。結(jié)果顯示，在最優(yōu)的條件下，線性范圍為0.05～1.00 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，檢出限（LOD） 為0.3～3.0 μg/kg，有機(jī)磷農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為70.3%～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） ＜10%。

2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS） 結(jié)合了液相色譜超強(qiáng)的分離能力與質(zhì)譜超強(qiáng)的組分鑒定能力，是一種分離及鑒定復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段。特別適用于沸點(diǎn)高、穩(wěn)定性差和揮發(fā)性低的化合物。與GC-MS 相比，HPLC-MS 選擇性好、干擾因素少，且兼具分離、定量和定性于一體，因此特別適用于有機(jī)磷化合物的檢測(cè)。但該方法也存在著一定的局限性，前處理繁雜、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本高、不適用現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)分析等。王雯等人[7]建立了一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)黃瓜中5 種具有代表性的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。用丙酮作為提取劑，佛羅里硅土凈化，以甲醇- 水為流動(dòng)相，采用ZORBAX SB-C18型色譜柱進(jìn)行分離，電噴霧離子化正模式（ESI+） 離子化，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM） 的條件下測(cè)定。結(jié)果顯示，方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好R2≥0.988，樂(lè)果與敵敵畏的定量限為0.002 mg/kg，敵百蟲(chóng)、殺螟硫磷和毒死蜱的定量限為0.01 mg/kg；回收率為72%～98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） ≤3.6%。梁達(dá)清等人[8]采用HPLC-MS 法檢測(cè)香菇中23 種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。用乙腈作為提取劑、鹽析分配，C18和N-丙基乙二胺粉末萃取凈化，采用VenusiIMP 色譜柱，電噴霧正離子方式及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的條件下測(cè)定。結(jié)果顯示，該方法定量限為0.01 mg/kg，回收率為70.2%～105.0%，RSD 值為3.5%～13.0%。

2.3 酶抑制法

早在20 世紀(jì)50 年代酶抑制法就已應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)。酶抑制法是指在一定條件下，酯酶可以水解催化羧酸酯類有機(jī)物，有機(jī)磷類化合物能夠抑制酯酶的活性，使酯酶失去催化作用，其抑制率與有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)，通過(guò)抑制率可以對(duì)樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行定性和半定量分析[9]。酶抑制法在檢測(cè)時(shí)反應(yīng)時(shí)間短、快速、操作簡(jiǎn)便，但是由于酶試劑易失活。因此，該方法結(jié)果不穩(wěn)定且重復(fù)性較差。于基成等人[10]采用酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，小麥為對(duì)照試驗(yàn)，比較了大豆、玉米等10 種植物中植物酯酶活性，系統(tǒng)地優(yōu)化了酶促反應(yīng)條件。研究結(jié)果表明，在最優(yōu)的條件下，該方法的回收率為86.7%～97.1%，對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、甲胺磷、久效磷和毒死蜱5 種有機(jī)磷農(nóng)藥的最小檢出限為0.13～0.24 μg/mL。邱朝坤等人[11]以鯽魚(yú)腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶（AChE） 為檢測(cè)用酶，檢測(cè)白菜、青椒、西紅柿、豆角、空心菜5 種蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)AChE 的抑制曲線方程，判斷樣品中農(nóng)藥殘留。結(jié)果表明，5 種蔬菜中均未出現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留超標(biāo)。除豆角外，此方法回收率為80%～20%，說(shuō)明該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 利用酶標(biāo)記抗原或抗體以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的一種非均相的免疫分析法。其基本原理是使抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面與某種酶結(jié)合成酶標(biāo)抗原或抗體，在底物的參與下，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與待測(cè)抗原或抗體成比例，因此可根據(jù)顏色的深淺或酶標(biāo)儀測(cè)定，來(lái)確定待測(cè)物是否存在及其含量[12]。ELISA 檢測(cè)速度快、靈敏度高，無(wú)需昂貴的設(shè)備，使該方法易于實(shí)施，更加適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣本檢測(cè)。而ELISA 所利用的乙酰膽堿酯酶、植物酯酶等具有制備成本高、受天然條件限制的缺點(diǎn)。鄒茹冰等人[13]建立了一種化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法，可以同時(shí)檢測(cè)對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷和殺螟硫磷3 種有機(jī)磷農(nóng)藥，比較了間接競(jìng)爭(zhēng)和直接競(jìng)爭(zhēng)2 種模式。試驗(yàn)結(jié)果表明，間接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)的3 種有機(jī)磷農(nóng)藥抑制中質(zhì)量濃度（IC50） 分別為對(duì)硫磷5.57 μg/kg，甲基對(duì)硫磷2.30 μg/kg，殺螟硫磷2.62 μg/kg，檢測(cè)線性范圍分別為0.39～100 μg/kg，0.39～25 μg/kg，0.39～25 μg/kg；直接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)3 種有機(jī)磷農(nóng)藥抑制中質(zhì)量濃度（IC50）分別為對(duì)硫磷5.43 μg/kg，甲基對(duì)硫磷1.34 μg/kg，殺螟硫磷1.24 μg/kg，檢測(cè)線性范圍分別為0.39～100.00 μg/kg，0.10～25 μg/kg，0.10～25 μg/kg。

2.5 生物傳感器

生物傳感器由識(shí)別元件（如酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、核酸等生物活性物質(zhì)） 和轉(zhuǎn)換元件（如電極、光學(xué)探測(cè)器、場(chǎng)效應(yīng)管等） 及檢測(cè)元件組成。生物傳感器是以生物敏感元件特異性識(shí)別生物活性物質(zhì)或特定化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)pH 值、電子或特定離子等物理化學(xué)信號(hào)的變化，并將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)元件放大、測(cè)量結(jié)果可以直接顯示在屏幕上[14-15]。與GC-MS，HPLC-MS 相比，生物傳感器簡(jiǎn)單、快速、選擇性高、成本低、專一性和抗干擾能力強(qiáng)，因此特別適用于有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)[16]。但此方法也存在著缺點(diǎn)，如回收率不高、可重現(xiàn)性不理想。Zhang J 等人[17]提出了一種實(shí)時(shí)和超痕量檢測(cè)4 種有機(jī)磷農(nóng)藥的微型交叉電極型傳感器，在微交錯(cuò)電極芯片表面修飾DNA 適配體，利用交流電動(dòng)力學(xué)加速有機(jī)磷分子與適配體探針結(jié)合，其電容變化率作為識(shí)別元件的定量指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器具有較寬的線性范圍為fM～nM，對(duì)水胺硫磷、丙溴磷、氧化樂(lè)果、甲拌磷4 種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)限為0.24～1.67 fM。Jinal B 等人[18]將乙酰膽堿酯酶通過(guò)酰胺鍵直接摻雜在羧基修飾的多壁碳納米管表面，用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥。其原理是將帶羧基的碳納米管沉積在玻碳電極上，然后用乙酰膽堿酯酶固定化，固定化之后用循環(huán)伏安法測(cè)定乙酰膽堿酯酶的活性，采用掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡對(duì)電極表面進(jìn)行了表征。在優(yōu)化參數(shù)的條件下，電極的線性范圍為10～50 nM，傳感器的檢測(cè)下限為0.1 nM，檢測(cè)上限為500 nM。

3 結(jié)語(yǔ)

圍繞有機(jī)磷農(nóng)藥殘留對(duì)人類的危害展開(kāi)論述，詳細(xì)介紹了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶抑制法、酶聯(lián)免疫吸附法和生物傳感器法在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。但是上述各有利弊，其中氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有選擇性好、檢測(cè)精度高、定量檢測(cè)效果好等優(yōu)點(diǎn)，但需要具有一定專業(yè)技術(shù)水平的人員才能操作，且檢測(cè)儀器昂貴，故不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；酶抑制法、酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感器法具有操作簡(jiǎn)便、高效快速等優(yōu)點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)樣品的快速初步篩選，而酶抑制法與酶聯(lián)免疫吸附法利用的乙酰膽堿酯酶、植物酯酶等具有制備成本高、受天然條件限制的缺點(diǎn)?？紤]到有機(jī)磷農(nóng)藥殘留對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境存在的潛在危害。因此，建立高效、快速和靈敏度高的定性定量分析方法具有重要意義。