張慶峰，吳祖芳

（上海實(shí)樸檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201100）

發(fā)酵蔬菜是指蔬菜在腌制過(guò)程中，利用有益微生物對(duì)蔬菜進(jìn)行加工的一種方式。在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)出多元化，生產(chǎn)如榨菜、泡菜及各種醬菜等不同的腌制食品[1]。由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等微生物組成的微生態(tài)環(huán)境，成為蔬菜的發(fā)酵體系[2]，蔬菜的泡制、腌制、醬制等不同的加工方法都不同程度地進(jìn)行微生物的發(fā)酵活動(dòng)[3]。發(fā)酵蔬菜的風(fēng)味不僅與新鮮蔬菜本身的風(fēng)味有關(guān)，同時(shí)，微生物的代謝活動(dòng)和發(fā)酵條件等因素對(duì)發(fā)酵蔬菜的風(fēng)味的形成起著至關(guān)重要的作用[4]。自然發(fā)酵和接種發(fā)酵是蔬菜發(fā)酵中常見(jiàn)的2 種形式，與自然發(fā)酵相比，接種發(fā)酵速度快、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸速度快且含酸量高，產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味都優(yōu)于自然發(fā)酵。因此，使用發(fā)酵劑的接種發(fā)酵方式在發(fā)酵蔬菜行業(yè)占有重要的地位。

乳酸菌發(fā)酵技術(shù)在發(fā)酵蔬菜加工中的應(yīng)用，以及產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、食用品質(zhì)及其產(chǎn)生的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益等方面有很好的益處[5-6]。不過(guò)也要嚴(yán)格控制發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)，安全性也是發(fā)酵蔬菜在加工中考慮的一個(gè)問(wèn)題，其中亞硝酸鈉含量是發(fā)酵蔬菜中的主要問(wèn)題。有研究表明，腌制蔬菜與同種新鮮蔬菜相比，亞硝酸鹽含量高出幾倍甚至幾十倍[7-8]，亞硝酸鈉本身沒(méi)有致癌性，但是能夠與氮化合物結(jié)合成具有致癌作用的亞硝胺，危害人體健康[9]。因此，嚴(yán)格控制發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鈉的含量，是蔬菜發(fā)酵過(guò)程必須要考慮的因素。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，用酵母菌、乳酸菌等多種有益菌發(fā)酵新鮮果蔬和食用真菌等原料，能夠制成營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的功能性發(fā)酵制品，富含多酚類、黃酮類、有機(jī)酸類、益生菌、益生元、維生素、礦物質(zhì)、生物酶等功效成分，具有抗氧化、消炎抑菌、改善腸道功能、提高免疫力、解酒護(hù)肝等功效[10-11]。

1 蔬菜發(fā)酵加工機(jī)理

利用食鹽的防腐作用、微生物的發(fā)酵作用、蛋白質(zhì)的分解作用和生物化學(xué)作用是蔬菜發(fā)酵的基本原理，并對(duì)有害微生物加以抑制，增加產(chǎn)品的獨(dú)特風(fēng)味，從而加強(qiáng)制品的保藏性能[12]。食鹽是蔬菜發(fā)酵中必不可少的物質(zhì)，利用食鹽形成的高滲透壓抽出蔬菜汁液，為乳酸菌生長(zhǎng)提供生長(zhǎng)基質(zhì)同時(shí)還具有緊實(shí)組織的作用，另外食鹽對(duì)微生物的生長(zhǎng)有抑制作用，還有防腐作用[13]。只有適量的食鹽才能充分實(shí)現(xiàn)這一作用。不加食鹽或少量食鹽不僅不能抑制有害微生物的生長(zhǎng)，在發(fā)酵后期發(fā)酵蔬菜會(huì)有不同程度的腐爛，還會(huì)有不同程度的異味；食鹽量過(guò)多會(huì)抑制有益菌的發(fā)酵速度及發(fā)酵作用，還會(huì)影響發(fā)酵品的質(zhì)量。因此，適量食鹽對(duì)蔬菜腌制發(fā)酵有至關(guān)重要的作用。

微生物的發(fā)酵作用主要有乳酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等，目前普遍認(rèn)為乳酸發(fā)酵是發(fā)酵蔬菜中最主要的發(fā)酵作用，但在蔬菜腌制過(guò)程中，乳酸菌屬確實(shí)起著重要的發(fā)酵作用。同型發(fā)酵和異型發(fā)酵是乳酸菌發(fā)酵的2 種方式，乳酸是同型發(fā)酵乳酸菌的重要代謝產(chǎn)物，不產(chǎn)氣，大量乳酸不僅能抑制雜菌的生長(zhǎng)，而且乳酸有保鮮功能，又可增強(qiáng)產(chǎn)品風(fēng)味[14]。除產(chǎn)生乳酸外，異型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵還產(chǎn)生二氧化碳、乙酸、乙醇、甘露醇等多種化合物，在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的各種生化反應(yīng)。例如，異型乳酸發(fā)酵、乙醇發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等發(fā)酵產(chǎn)生的乙醛、甘露醇、乙酸、乙醇等風(fēng)味化合物，形成了發(fā)酵蔬菜特有的口感和風(fēng)味[15-16]。由于異型乳酸菌產(chǎn)酸量較少，異型乳酸菌的發(fā)酵活動(dòng)隨著乳酸的積累受到了抑制，不過(guò)異型乳酸菌在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)物和發(fā)酵機(jī)理都是比較復(fù)雜的[17]。此外，也有對(duì)發(fā)酵制品品質(zhì)不利的發(fā)酵（丁酸發(fā)酵），應(yīng)盡量避免這種不利發(fā)酵的進(jìn)行。

蔬菜一般都含有一定量的蛋白質(zhì)，在蔬菜發(fā)酵加工過(guò)程中，蛋白質(zhì)及氨基酸的變化對(duì)制品的色、香、味有不同的影響。有些氨基酸是由微生物蛋白酶分解蛋白質(zhì)而逐漸釋放出來(lái)的，眾所周知，氨基酸都是有一定的甜味和鮮味，其鮮味一般是由谷氨酸與食鹽作用所產(chǎn)生的；氨基酸在酸的作用下變成醇，醇與酸化合為酯, 產(chǎn)生香味[18]。此外，許多風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)就是氨基酸，如許多芳香化合物的前體物質(zhì)是蛋氨酸、芳香氨基酸和側(cè)鏈氨基酸，甲烷硫醇是由蛋氨酸代謝產(chǎn)生的，在醛縮酶的作用下，蘇氨酸分解產(chǎn)生甘氨酸和乙醛[19]。

總之，發(fā)酵蔬菜的組織脆性及色、香、味都與糖類的發(fā)酵作用和蛋白質(zhì)的分解作用有密切的關(guān)系。研究發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵加工機(jī)理對(duì)提高發(fā)酵制品的品質(zhì)和風(fēng)味的形成有重要作用。

2 發(fā)酵蔬菜的微生態(tài)

蔬菜的腌制發(fā)酵必然離不開(kāi)微生物及其生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的有益物質(zhì)，分析發(fā)酵體系中微生物的多樣性，對(duì)于改善發(fā)酵條件及提高品質(zhì)有好處。20 世紀(jì)60 年代，Pederson C S 等人[20]對(duì)酸白菜和酸黃瓜等發(fā)酵體系中的菌系消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)明串球菌在早期發(fā)酵中起著主要作用，在發(fā)酵中期，啤酒片球菌、短乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵活躍，大量產(chǎn)酸，在蔬菜發(fā)酵體系后期，由植物乳桿菌發(fā)酵完成?？到ㄒ赖热薣21]采用Illumina HiSeq 對(duì)山西地方自然發(fā)酵蔬菜不同發(fā)酵時(shí)期的樣品中細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，發(fā)酵前期細(xì)菌多樣性豐富，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，發(fā)酵中后期樣品主要菌屬為乳桿菌屬。翁佩芳等人[22]采用16S rDNA 克隆文庫(kù)法對(duì)榨菜不同鹽度腌制體系中微生物多樣性進(jìn)行了分析。研究表明，在5%食鹽腌制過(guò)程中，發(fā)酵前期中的優(yōu)勢(shì)種群是乳桿菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬；而在7%食鹽腌制過(guò)程中，希臘魏斯氏菌是發(fā)酵前期中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌種，最后起主導(dǎo)作用的種群均為植物乳桿菌。沈錫權(quán)等人[23]采用16S r DNA 基因克隆文庫(kù)的方法，對(duì)腌制成熟的莧菜梗中細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行了分析，共檢測(cè)出了乳桿菌、類香菌、弓形桿菌等6 個(gè)菌屬，其中乳桿菌屬占優(yōu)勢(shì)為總數(shù)的83.9%。谷懿寰等人[24]經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)，再通過(guò)16S rRNA 基因序列分析和熒光定量PCR 技術(shù)，對(duì)海南7 個(gè)地區(qū)的30 份不同種類的發(fā)酵竹筍、小西瓜、白菜和豆角樣品中的微生物進(jìn)行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在海南蔬菜腌制體系中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬是乳桿菌屬，在海南蔬菜發(fā)酵體系中的優(yōu)勢(shì)菌種是植物乳桿菌。張騰[25]利用DGGE 方法，對(duì)蔬菜發(fā)酵體系中細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行了鑒定，在食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的發(fā)酵體系中，在發(fā)酵前后期，細(xì)菌和真菌群落是比較豐富的，在發(fā)酵后期細(xì)菌種類較多，而中期細(xì)菌種類相對(duì)比較單一；在食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的發(fā)酵蔬菜體系中，細(xì)菌群落在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中都是相對(duì)穩(wěn)定的，但細(xì)菌種類數(shù)比較少，真菌群落在發(fā)酵初期的種類相對(duì)單一，但生物量很高，到發(fā)酵后期真菌群落物種相對(duì)豐富；食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，細(xì)菌群落發(fā)酵前期種類有限，發(fā)酵中后期物種相對(duì)豐富，而真菌主要存在于發(fā)酵初期。依據(jù)蔬菜在發(fā)酵過(guò)程中的物理變化和發(fā)酵時(shí)間可劃分為4 個(gè)階段，即初發(fā)酵、主發(fā)酵、再發(fā)酵和后發(fā)酵，在前面3 個(gè)階段，有益菌群和兼性菌群發(fā)酵活動(dòng)比較活躍，在初發(fā)酵階段或者有氧的后發(fā)酵階段會(huì)存在有害菌群的微生物活動(dòng)[26]。微生物的群落結(jié)構(gòu)在整個(gè)蔬菜腌制體系中的變化，是發(fā)酵體系環(huán)境隨發(fā)酵時(shí)間推移而產(chǎn)生變化的最好體現(xiàn)。另外，對(duì)蔬菜產(chǎn)品特性也起著決定性的作用[27]。因此，為了更好地判斷和評(píng)估發(fā)酵蔬菜的腌制過(guò)程，了解發(fā)酵過(guò)程中微生物種群之間的演替關(guān)系是最好的選擇。

3 發(fā)酵蔬菜的質(zhì)量控制

在發(fā)酵食品發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)酸含量的變化是評(píng)價(jià)發(fā)酵工藝的重要指標(biāo)之一[28]。酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸和草酸是蔬菜中比較常見(jiàn)的有機(jī)酸，其中酒石酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸的味道比較柔和，刺激性較小，對(duì)增進(jìn)蔬菜的風(fēng)味有著重要的作用[29]。乳酸菌在蔬菜發(fā)酵體系中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，不僅抑制雜菌污染，增加蔬菜的營(yíng)養(yǎng)成分，保持蔬菜的色香味，使產(chǎn)品的感官品質(zhì)提升，還能節(jié)約能源。乳酸菌的發(fā)酵性能不僅能縮短發(fā)酵時(shí)間，而且還能提高泡菜的品質(zhì)，在延長(zhǎng)泡菜的食用期和降低亞硝酸鹽的含量等多方面都產(chǎn)生了重要的作用[30]。不同的發(fā)酵方式，發(fā)酵蔬菜的口感和品質(zhì)都有所差異。Ishikawa K 等人[31]通過(guò)對(duì)腸膜明串珠菌腸膜亞種和干酪乳桿菌干酪亞種混合發(fā)酵的日本傳統(tǒng)泡菜紅蘿卜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，混合菌發(fā)酵紅蘿卜的色澤和風(fēng)味都比較好，不會(huì)產(chǎn)生含硫類物質(zhì)，影響產(chǎn)品的風(fēng)味，并且能長(zhǎng)期保持產(chǎn)品的鮮艷色澤，增加食欲。范麗平等人[32]分別接種乳酸菌菌株Mao24.1，Mao5.1 和Tang3.2 于泡菜與自然發(fā)酵比較分析，接種發(fā)酵泡菜產(chǎn)品香氣濃郁，各指標(biāo)均優(yōu)于自然發(fā)酵泡菜。周光燕等人[33]將干酪乳桿菌干酪亞種、植物乳桿菌短乳桿菌、棒狀乳桿菌棒狀亞種、布氏乳桿菌等5種乳酸菌分別接種于5 組泡菜，分別作為泡菜中的優(yōu)勢(shì)菌，并與傳統(tǒng)的自然發(fā)酵泡菜方式進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，植物乳桿菌可以明顯縮短泡菜的發(fā)酵周期，泡菜的色、香、味明顯較好，顯著降低了亞硝酸鹽的含量[34]。

在發(fā)酵過(guò)程中加入一定量的仔姜、大蒜、八角、辣椒等香辛料，可以加強(qiáng)泡菜的風(fēng)味和口感，還能夠抑制一些雜菌，并有一定的防腐作用[29]。Cavalcanti N B 等人[35]通過(guò)在泡菜中添加維C 和檸檬酸進(jìn)行研究，結(jié)果表明在泡菜中分別加入維C 和檸檬酸，都比不加入的品質(zhì)要好，而且加入維C 發(fā)酵后產(chǎn)品的品質(zhì)效果比加入檸檬酸發(fā)酵后的品質(zhì)效果好。劉程惠等人[36]研究了幾種輔料對(duì)甘藍(lán)泡菜自然發(fā)酵過(guò)程中成分變化，發(fā)現(xiàn)白砂糖、香辛料和水果的添加有利于發(fā)酵過(guò)程中總酸的增加。楊瑞等人[37]在泡菜發(fā)酵過(guò)程中主要化學(xué)成分變化規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)低食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加碘、加花椒的方法有利于產(chǎn)酸。此外，采用含有較多礦物質(zhì)的硬水配制泡菜鹽水，效果更好，可以保持泡菜成品的脆性[29]。

蔬菜是一種富集硝酸鹽的植物性食品。由于在蔬菜上存在硝酸鹽，而硝酸鹽在一些還原性菌的作用下還原成致癌性的亞硝酸鹽[38]。亞硝酸鹽問(wèn)題是發(fā)酵蔬菜中一直需要考慮的安全因素，亞硝酸鹽含量高低關(guān)乎產(chǎn)品的品質(zhì)和可食性。充分利用乳酸菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵產(chǎn)生的高酸環(huán)境加速亞硝酸鹽的降解，而且增加酸度，能夠抑制有害的微生物，并對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行有效的分解破壞，由于亞硝酸鹽與酸作用產(chǎn)生游離酸和亞硝酸，而亞硝酸極不穩(wěn)定，容易分解產(chǎn)生無(wú)害的NO[39]，有研究表明，采用人工接種乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行發(fā)酵，大大縮短發(fā)酵周期，產(chǎn)酸迅速，可抑制雜菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低亞硝酸鹽的形成，提高發(fā)酵制品的品質(zhì)和貨架期。