楊 艷，瞿明仁，歐陽(yáng)克蕙，婁佑武，甘興華，饒 輝，王榮民，顧 瑤，江 航

(1.江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西 南昌 330046；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江西 南昌 330045)

瘤胃微生物對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)具有重要的影響。它能使反芻動(dòng)物能夠利用發(fā)酵植物性蛋白、多糖以及纖維素等，以產(chǎn)生動(dòng)物機(jī)體維持生長(zhǎng)所必需的能量與養(yǎng)分[1,2]；另一方面，在瘤胃中進(jìn)行的大量復(fù)雜的代謝過程中產(chǎn)生的各種代謝物也被微生物用于自身的增殖[3]。因此，開展對(duì)瘤胃微生物的研究，對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。

1 瘤胃微生物區(qū)系的組成

1.1 瘤胃細(xì)菌

細(xì)菌是瘤胃微生物中含量最為豐富、多樣，代謝最為活躍的一類。瘤胃細(xì)菌根據(jù)功能大體可以劃分為成纖維降解菌、半纖維降解菌、淀粉降解菌、糖類分解菌、利用酸菌、蛋白分解菌、產(chǎn)甲烷菌、脂肪分解菌等。瘤胃細(xì)菌革蘭氏陰性菌占大多數(shù)，但是革蘭氏陽(yáng)性菌在高能量日糧飼喂條件下有增加的趨勢(shì)。瘤胃內(nèi)的纖維降解菌的數(shù)量最大，主要包括了瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、梭菌等。研究者們通過電子顯微鏡[4]以及定量 PCR技術(shù)[5]發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)作為瘤胃內(nèi)主要的纖維降解菌在纖維的降解過程中最為重要，分泌的纖維素酶活性最高[6]。在飼喂高比例淀粉含量的日糧時(shí)，瘤胃淀粉降解菌的比例將增加。淀粉降解菌主要包括牛鏈球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌及反芻獸新月型單胞菌。瘤胃內(nèi)功能細(xì)菌大多數(shù)具有特定的蛋白酶活性，瘤胃嗜淀粉菌是目前已知的活性最高的瘤胃蛋白分解菌；具有較高的蛋白質(zhì)降解活性的還有棲普雷沃氏菌(Prevotella)、反芻獸新月型單胞菌(Selenomonasruminantium)、牛鏈球菌(Streptococcusbovis)。乳酸利用細(xì)菌包括新月形單胞菌(Selenomonas)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)以及向堿性韋榮氏球菌(Veillonella)。目前研究認(rèn)為瘤胃細(xì)菌中產(chǎn)乳酸較多的是乳酸桿菌(Lactobacillus)和牛鏈球菌。

瘤胃微生物主要存在于瘤胃液、瘤胃內(nèi)容物及瘤胃上皮上附著。瘤胃液內(nèi)的細(xì)菌又稱液相細(xì)菌，屬嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，最易獲得且研究較多。瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌是指定植附著于固態(tài)飼料顆粒上面的細(xì)菌，又稱固相細(xì)菌，其通過附著固相底物而分泌產(chǎn)生酶并將附著的底物消化降解從而獲取養(yǎng)分。固相細(xì)菌中包含著大量能分解利用纖維的纖維降解菌，產(chǎn)生較液相細(xì)菌數(shù)量更多的多糖酶，并且總酶活是液相的100倍之多[7]，所以瘤胃固相細(xì)菌是降解纖維素的最重要的組成成分。在研究荷斯坦奶牛瘤胃液相與固相中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，液、固相細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異相差較大，其中低鳥嘌呤和胞嘧啶含量的革蘭氏陽(yáng)性菌在瘤胃液相中的比例為52.4%，在瘤胃固相中的比例為71.4%[8]。

1.2 瘤胃原蟲和真菌

瘤胃內(nèi)原蟲的含量低于細(xì)菌，其個(gè)體較大，纖毛蟲是原蟲中個(gè)體最大、數(shù)量最多的。徐淮白山羊瘤胃中原蟲密度為2.26×105個(gè)/mL，占瘤胃微生物量的44.83%[9]。瘤胃內(nèi)原蟲會(huì)吞食淀粉、脂肪，從而保障瘤胃pH值穩(wěn)定在固定的范圍內(nèi)，對(duì)維持微生物生態(tài)系統(tǒng)的平衡起到一定積極的作用[10]；并會(huì)分泌纖維水解酶，降解植物細(xì)胞壁[10]，使得瘤胃干物質(zhì)降解率[11]、蛋白質(zhì)降解率、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維的降解率[12]得到大幅度提高。目前發(fā)現(xiàn)的瘤胃真菌劃分為6個(gè)菌屬18種，分為Anaeromyces、Orpinmyces和Cyllamyces的多中心菌體，Neocallimastix、Piromyces和Caecomyces的單中心菌體。前人從飼喂青干草的山羊瘤胃液中分離到四類厭氧真菌，分屬于Orpinomyces、Anaeromyces、Piromyces和Neocallimastic[13]。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)降解日糧中木質(zhì)纖維素最有效的一類微生物類群是瘤胃內(nèi)的厭氧真菌[14]。

2 影響瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的因素

2.1 宿主

宿主是影響反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的最重要的因素之一。宿主不同，其瘤胃內(nèi)的微生物種類、數(shù)量均不相同。比較分析魯西肉牛、荷斯坦奶牛、晉南牛、黃牛、牦牛以及Hanwoo的9個(gè)16SrDNA文庫(kù)組成及序列多樣性發(fā)現(xiàn)：魯西肉牛瘤胃細(xì)菌文庫(kù)中的91%克隆來自未培養(yǎng)細(xì)菌，擬桿菌和梭菌為優(yōu)勢(shì)菌群；采食不同日糧的荷斯坦奶牛個(gè)體間的16SrDNA文庫(kù)組成差異不明顯，但與亞洲品種如黃牛、魯西牛的16SrDNA文庫(kù)組成的差異較顯著[15]。對(duì)比沼澤型水牛、大額牛瘤胃中、荷斯坦牛的16sRNA基因序列后發(fā)現(xiàn)，溶纖維丁酸弧菌僅在大額牛和水牛中發(fā)現(xiàn)，雙孢梭菌、硫氧化細(xì)菌、略紫色梭菌等細(xì)菌僅在水牛中發(fā)現(xiàn)，生黃瘤胃球菌僅存在于水牛與荷斯坦牛中，3個(gè)品種均有瘤胃解琥珀酸菌和瘤胃假丁酸弧菌[16]。在相同日糧飼養(yǎng)條件下，水牛的黃色瘤胃球菌和厭氧真菌數(shù)量低于印度家牛，纖維素降解菌數(shù)量高于印度家牛[17]。云南大額牛對(duì)高纖維粗料的消化能力明顯高于本地黃牛，其主要原因是云南大額牛瘤胃中纖維素降解菌比本地黃牛多，并且含有大量的毛螺菌等[18]。研究比較荷斯坦奶牛、波爾山羊、梅花鹿的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)：荷斯坦奶牛的優(yōu)勢(shì)菌為Pseudobutyrivibrioruminis(假丁酸弧菌)、Eubacteriumruminantium(反芻真桿菌)；波爾山羊的優(yōu)勢(shì)菌為Clostridium(梭菌屬)；梅花鹿的優(yōu)勢(shì)菌為Prevotella(普雷沃氏菌屬)、Succinivibriodextrinosolvens(溶糊精琥珀酸弧菌)[19]。當(dāng)飼喂同一日糧時(shí)，綿羊瘤胃內(nèi)的原蟲數(shù)量顯著低于山羊[20]。山羊家畜亞科(Caprahircus)和阿爾卑斯野山羊(Caprapyrenaicahispanica)兩個(gè)品種的瘤胃原蟲多樣性研究結(jié)果表明，原蟲多樣性在兩個(gè)山羊種屬內(nèi)的差異小于種屬間的差異[21]。

2.2 生理階段

反芻動(dòng)物從出生到2歲期間瘤胃微生物區(qū)系有較大變化。瘤胃為厭氧環(huán)境，其中的細(xì)菌是厭氧菌。但在幼齡時(shí)，瘤胃的微生物不完全是厭氧的。通過體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，反芻動(dòng)物在幼齡階段，其瘤胃微生物區(qū)系含有兼性厭氧菌與需氧菌；但隨著日齡的增長(zhǎng)，瘤胃發(fā)酵功能的日趨成熟，厭氧菌完全替代了這類菌群[22-24]。在成年的反芻動(dòng)物瘤胃微生物中，細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成從門水平上分析，主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門[25,26]。成熟反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，而幼齡期瘤胃微生物區(qū)系隨著出生后時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)有數(shù)量和種類上的明顯變化。8～10月齡犢牛瘤胃微生物區(qū)系檢測(cè)到2095個(gè)細(xì)菌的操作分類單元(OTU)，分屬于24個(gè)細(xì)菌門類，其中57.2%的OTU屬擬桿菌門，26.8%的OTU屬厚壁菌門[27]。但7～63日齡的犢牛瘤胃微生物區(qū)系中細(xì)菌的OTU只有1588個(gè)，能檢測(cè)到的只有 23 個(gè)細(xì)菌門類[28]。具體到細(xì)菌種類上，對(duì)初生犢牛的瘤胃微生物區(qū)系使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門在出生后第1～3天時(shí)占比極高，甚至超過厚壁菌門和擬桿菌門，但是隨著時(shí)間的推移，變形菌門所占比例也在逐漸減少[23]。在研究瘤胃細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門在動(dòng)物出生第3天時(shí)成為了占比例最高的菌門，在83日齡前最高時(shí)甚至可以占到 62.1%[29]。上述研究證實(shí)了瘤胃微生物區(qū)系在一定程度上也受年齡(日齡)因素的影響。

2.3 日糧

前人針對(duì)不同品種及飼喂日糧類型對(duì)瘤胃微生物菌群變化的影響做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)日糧因素對(duì)瘤胃菌群的影響比品種因素方面要更為顯著[30-31]。在對(duì)飼喂不同精粗比日糧的8～10月齡的荷斯坦奶牛開展的瘤胃微生物區(qū)系研究結(jié)果表明，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門的豐度較高，平均豐度分別為57.2%、26.8%和10.3%左右，并且隨著精料水平的提高，F(xiàn)ibrobacteres的豐度逐漸下降。利用16SrRNA測(cè)序技術(shù)測(cè)定高牧草組和高精料組的牦牛細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)高牧草組的BacteroidalesBS11，PrevotellaceaeUCG-003，RuminococcaceaeUCG-011，BacteroidalesRF16和RuminococcaceaeUCG-010的豐度高于高精料組，而BacteroidalesS24-7、RuminococcaceaeNK4A214、Succiniclasticum以及Ruminococcus2的相對(duì)比例低于高精料組[32]。日糧類型對(duì)瘤胃真菌Neocallimastigalesassemblages有較大的影響[33]。同時(shí)，一些研究也指出在日糧中添加大蒜油[34]、豆油胡、麻油[35]等植物油以及莫能霉素、維吉尼亞霉素等抗生素[36]、益生菌酵母等微生態(tài)制劑[37]以及硫胺素等維生素[38]均能在一定程度上影響瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式的目的。同時(shí)，也有研究指出在日糧中添加煙酸后提高了瘤胃的原蟲數(shù)量和密度，促進(jìn)了原蟲生長(zhǎng)[11,39]，特別是提高了纖毛蟲的數(shù)量[11]。

2.4 定植部位

研究發(fā)現(xiàn)羊瘤胃內(nèi)微生物在液相與固相中的分布存在明顯的差異[40]。在飼用全價(jià)混合日糧的奶牛瘤胃中，液相的棲瘤胃普氏菌(Prevotellaruminicola)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、牛鏈球菌(Streptococcusbovis)的比例較高，而在固相中白色瘤胃球菌(Rumincoccusalbus)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、反芻真桿菌(Eubacteriumruminantium)的比例較高[41]。在肉牛瘤胃微生物研究中發(fā)現(xiàn)，飼用粗飼料日糧為主的肉牛瘤胃解琥珀酸弧菌(Succiniclasticum)和Paludibacter在液相的比例比固相中的高，而普氏菌屬和螺旋體屬在固相的比例比液相高，分布在瘤胃固相內(nèi)容物上的分解纖維類的微生物比例要比液相的高。反芻動(dòng)物在飼喂粗飼料和混合粗飼料的瘤胃上皮微生物區(qū)系的相似性較高，而飼喂高比例精料日糧的瘤胃上皮微生物區(qū)系的相似性較低[42]。在瘤胃上皮細(xì)菌中厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌，且上皮微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)比固相、液相微生物的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[43]。

3 瘤胃微生物菌群研究方法進(jìn)展

瘤胃微生物群落是最復(fù)雜的生物體系之一，有著豐富的基因資源和生態(tài)資源。傳統(tǒng)的瘤胃微生物研究的前提是必須通過體外培養(yǎng)獲得目的菌株，才能對(duì)其性質(zhì)等進(jìn)行描述研究。但瘤胃微生物的自然生長(zhǎng)環(huán)境復(fù)雜并且嚴(yán)格厭氧，導(dǎo)致瘤胃細(xì)菌不到20%的種類可以體外培養(yǎng)[43]，而80%以上的種類無(wú)法開展研究，且體外培養(yǎng)不能完全模擬瘤胃微生物所處的瘤胃微生物共生的真實(shí)環(huán)境，所以傳統(tǒng)的研究方法的局限性限制了人們對(duì)瘤胃微生物的生態(tài)功能研究。直到20世紀(jì)80年代后，人們開始利用分子生物學(xué)技術(shù)通過瘤胃微生物的遺傳物質(zhì)DNA對(duì)其功能及多樣性方面進(jìn)行了研究[44,45]。利用分子生物學(xué)技術(shù)，可以直接對(duì)微生物的DNA或者RNA序列進(jìn)行分析，從而極大地促進(jìn)了對(duì)瘤胃內(nèi)未培養(yǎng)微生物的研究。1993年Krumholz等利用分析核糖體RNA小亞基基因序列，將體外培養(yǎng)從未獲得的瘤胃細(xì)菌卵狀奎因氏菌成功地做了分類確定[46]。早期采用分子生物學(xué)技術(shù)開展瘤胃微生物研究的方法主要有單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、熒光原位雜交(FISH)、Real-time PCR等。這些技術(shù)方法雖反映出了瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)組成的信息，但由于存在分辨識(shí)別度不高等缺點(diǎn)，所以也不能全面反映出瘤胃微生物多樣性，通過此類方法獲得的微生物信息量明顯少于實(shí)際情況[47]。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，1998年由Handelsman等提出的宏基因組學(xué)近年來在研究瘤胃微生物方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。它可以繞過培養(yǎng)未能培養(yǎng)的微生物這一技術(shù)局限，并且能研究特定環(huán)境中可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的全部微生物信息的總和[48]。早期的宏基因組學(xué)主要是直接提取特定環(huán)境中的總DNA，克隆到可培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，通過重組克隆子的序列和功能分析挖掘出那些未能培養(yǎng)的微生物信息。Daniel等[49]和Ufarte等[50]對(duì)文庫(kù)構(gòu)建方法和功能篩選作了詳細(xì)介紹。研究者們已經(jīng)將宏基因組學(xué)的技術(shù)成功應(yīng)用到瘤胃、土壤等特定環(huán)境中的纖維素酶[51]和脂酶[52]的研究中。隨著二代測(cè)序技術(shù)的興起，擴(kuò)增子以及全基因組測(cè)序是宏基因組學(xué)的兩個(gè)主要的研究方向。擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)主要用于開展特定環(huán)境下微生物群落區(qū)系的結(jié)構(gòu)和豐度等信息的研究，全基因組測(cè)序則主要用于開展微生物群落功能的研究。應(yīng)用Roche454 FLX或Illumina MiSeq等測(cè)序平臺(tái)對(duì)微生物宏基因組的16S/18S小亞基rRNA或DNA序列進(jìn)行測(cè)序，將讀出的序列除雜優(yōu)化后，用Mothur或QIIME生成可操作分類單元OTU，從各OTU中挑選1條代表性序列與微生物數(shù)據(jù)庫(kù)(SILVA、Greengenes、RDP)進(jìn)行比對(duì)分析，可以得到該特定環(huán)境中的物種分類及豐度信息[53]。2014年Roggenbuck等采用Roche454 FLX測(cè)序發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)頸鹿瘤胃微生物中有20%的細(xì)菌序列為首次發(fā)現(xiàn)，且瘤胃固液相優(yōu)勢(shì)菌均為Firmicute、Bacteridetes菌門[54]。研究者們采用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)牛的瘤胃微生物多樣性的研究還發(fā)現(xiàn)個(gè)體對(duì)細(xì)菌的多樣性有較大影響，并指出不同的個(gè)體中僅51%的細(xì)菌分類是相似的[55]。

擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)主要用于研究微生物群落結(jié)構(gòu)，而無(wú)法滿足微生物功能研究的要求。但近年來基于擴(kuò)增子測(cè)序的PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析開始發(fā)展起來，與宏基因組研究相比，PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析研究成本更低，同時(shí)預(yù)測(cè)的效果可靠性較高，因而開始被研究者們關(guān)注并采用[56]。目前該方法已在土壤細(xì)菌功能研究中得到應(yīng)用，為細(xì)菌功能研究提供了更多可靠信息[57-59]。