岳婭東 尹盈愛 白樺 張慶 董益陽

1.北京化工大學生命科學與技術學院 北京 100029

2.中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100124

隨著社會不斷地進步與發(fā)展，人們漸漸對服裝的需求不再僅是保暖、舒服，還希望其更健康、環(huán)保。但由于在農作物生長期間反復使用農藥殺蟲劑[1]，導致紡織品從原料源頭到加工成成品的過程中都可能存在農藥殘留，而有機磷類農藥是紡織品中主要殘留的農藥[2]。殘留的有機磷農藥對人體健康的危害巨大。據統(tǒng)計，農藥中毒有75.4%歸因于有機磷農藥[3]。有機磷農藥可通過經皮吸收等方式進入人體，隨后會出現不同程度的中毒癥狀，會產生嘔吐、惡心、視力模糊、呼吸困難等現象，甚至死亡[4]。因此，《生態(tài)紡織品技術要求》對紡織品中對硫磷等60 種農藥殘留量做出了明確規(guī)定，要求嬰兒產品中農藥殘留量不超過0.5mg/kg，非嬰兒產品中農藥殘留量不超過1.0mg/kg[5]。

傳統(tǒng)的檢測有機磷農藥的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法等儀器分析法，此類方法不僅成本高、對操作人員要求較高且樣品前處理步驟繁瑣[6]。相較于大型儀器檢測方法，快速檢測技術具有便捷輕巧，成本低廉等優(yōu)勢，且能實現現場檢測，目前主要包括免疫分析法、酶抑制法及生物傳感器技術等[7-9]。免疫分析法主要利用抗原與抗體的反應，進行有機磷農藥的定性和定量檢測，其優(yōu)點是成本低，周期短。本文所采用的就是免疫分析法中比較有代表性的技術——酶聯免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA），此方法常被用于有機磷農藥殘留的檢測分析中[10]。

本試驗以三唑磷、甲基對硫磷、對硫磷為研究對象，利用識別這三種農藥的特異性單克隆抗體，建立并優(yōu)化了酶聯免疫的間接競爭檢測方法，為快速、經濟、高效檢測有機磷農藥提供了一種新手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

三唑磷抗原、對硫磷抗原、甲基對硫磷抗原、三唑磷抗體、對硫磷抗體、甲基對硫磷的鼠源抗體，HRP（辣根過氧化物酶）-羊抗鼠IgG 羊抗鼠-HRP 酶標二抗；多種有機磷農藥標準品購買于北京信方源生物科技有限公司；口水巾、毛巾、襪子均購自北京天豐利市場；配制：包被液（0.05M PBS，pH9.6）、稀釋液（0.01M PBS，pH7.4）、洗滌緩沖液（0.01M PBST；pH7.4，0.05% 吐溫-20）、封閉液（3%的牛血清蛋白）、過氧化物酶底物TMB 顯色A、B 液、終止液（2M H2SO4）。

8 通道排槍、電子天平、超純水器、PH 計、離心機、恒溫水浴鍋、混勻儀、酶標儀、恒溫冰箱、96 孔透明酶標板、移液槍、超聲振蕩儀、旋轉蒸發(fā)儀。

1.2 實驗方法

（1）間接競爭酶聯免疫法（Indirect Competition ELISA，ic-ELISA）檢測原理及操作步驟：

原理：包被在酶標板上的抗原與有機磷標準品或樣品中的有機磷農藥競爭特異性抗體，反應后形成抗原-抗體復合物。若標準品或樣品中的有機磷農藥濃度低，與包被抗原結合的抗體就多，反之亦然。加入酶標二抗后用底物液顯色。顯色越淺，吸光度會越小，抑制率越高，則抗體的特異性越強。

步驟：用包被緩沖液將抗原稀釋到最佳濃度，每孔100μL加入96 孔板中，37℃恒溫2 小時；用移液槍吸取PBST，每孔200μL，加入96 孔板中洗滌3 次；加入封閉液每孔200μL，37℃恒溫2 小時；PBST 洗板3 次；用稀釋緩沖液將有機磷農藥標準品按梯度稀釋好，每孔加50μL，再加入稀釋好的抗體每孔50μL，搖勻后在37℃下靜置30min；PBST 洗板3 次；將稀釋好的酶標二抗加入96 孔板中，每孔100μL，37℃下靜置30min；PBST 洗板3 次；將底液A 、B 按1：1 比例混合均勻，每孔100μL 加入96 孔板中，37℃下靜置20min；吸取終止液每孔100μL 加入酶標板中；用酶標儀在波長450nm 下進行讀數，即為OD450 值。

（2）抗原、抗體的最佳工作濃度-棋盤法。酶標二抗的濃度參考說明書用稀釋緩沖液稀釋為5000 倍。用包被緩沖液和稀釋緩沖液分別將抗原抗體進行梯度稀釋后，類似棋盤式設計，在酶標板上不加校準物，進行直接ELISA。在450nm 讀取吸光度。選擇OD450 ≈1.5 為抗原抗體最佳工作濃度。

（3）標準曲線及交叉反應率。將所用的農藥標準品分別稀釋 為1ppb、5ppb、10ppb、50ppb、100ppb、200ppb， 依 據IC-ELISA 的步驟；將酶標板的第一行設為空白組，即所加農藥為0ppb，最后一行設為對照組，即不加農藥和一抗，用PBS 來代替以保證與實驗組的體積相同，在波長450nm 處讀取各吸光度值。重復上述三次，取各平均值，分析數據并計算得出抑制率（%）=[（OD 空白組-OD 實驗組）/（OD 空白組-OD 對照組）]×100%，擬合標準曲線。根據曲線擬合得到方程，抑制率50%時為半數抑制濃度IC50，抑制率15%時為檢出限IC15。

交叉反應率（Cross Reaction，CR）反映受檢物質在干擾物存在下的特異性，交叉反應率越低，抗體特異性越強。用受檢物質的IC50 除以干擾物的IC50，即為對照濃度的交叉反應率，即交叉反應率（%）=（受檢物質的IC50/干擾物的IC50）×100%。

（4）加標實驗?；厥章适菣z驗ELISA 方法是否實際可行的一項重要數據，可通過加標實驗得到回收率數據。一般認為回收率在70%-120%時，檢測方法準確可靠。分別把口水巾、毛巾、襪子洗凈用超純水浸泡過夜，烘干后取純白色無印花部分1g，剪成5mm×5mm，放入50mL 離心管混勻；加入2μL 的三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷農藥原液（100μg/mL），室溫靜置15min；在離心管中加入20mL 乙酸乙酯，超聲20min，將提取液濾出；殘渣再用10mL 乙酸乙酯超聲5min，將兩次濾液合并。將濾液在40℃水浴旋蒸濃縮至干，殘留物用1mL5%的甲醇-PBS 溶解，即得200ng/mL 的加標樣品用于測定。

2 結果與討論

2.1 實驗條件優(yōu)化

將三唑磷組抗原抗體分別稀釋：5000，10000，15000，20000，25000，30000，40000 倍；對硫磷組抗原抗體分別稀釋為：2000，4000，5000，8000，10000，12000，15000，16000倍；甲基對硫磷組抗原和抗體分別稀釋為：2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，10000 倍。測得吸光度如圖1-3。選擇OD450 ≈1.5 時，三唑磷組、對硫磷組、甲基對硫磷組抗原抗體的最佳工作稀釋倍數分別都是：10000、5000、2000。

圖1 三唑磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure1 Triazophos concentration optimization

圖2 對硫磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure2 Parathion concentration optimization

圖3 甲基對硫磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure3 Methyl parathion concentration optimization

2.2 靈敏度和特異性

用三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷此三對抗原抗體在本試驗最佳工作濃度下進行ic-ELISA，測定結果采用logistic 模型擬合四參數方程，標準曲線如圖4-6 所示。三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷的檢出限IC15 分別為：2.621ng/mL、3.357ng/mL、2.780ng/mL；半數抑制濃度IC50 值分別為：28.468ng/mL、37.787ng/mL、64.185ng/mL。

圖4 三唑磷農藥與三唑磷抗原抗體標準曲線Figure4 Standard curve of triazophos pesticide and triazophos antigen antibody

本試驗分別用多種結構相似的有機磷農藥作為干擾物質進行特異性實驗，交叉反應率如表1 所示。三唑磷、對硫磷組特異性良好，甲基對硫磷組抗原抗體可識別對硫磷農藥，其檢出限為3.230ng/mL，半數抑制濃度為99.566ng/mL，交叉反應率為64.465%。

圖5 對硫磷農藥與對硫磷抗原抗體標準曲線Figure5 Standard curve of parathion pesticide and parathion antigen antibody

圖6 對硫磷、甲基對硫磷農藥與甲基對硫磷抗原抗體標準曲線Figure6 Standard curve of parathion，methyl parathion pesticides and methyl parathion antigen antibody

2.3 回收率

取制備好的加標樣品替代農藥標準品進行IC-ELISA 測定，三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷這三種農藥在口水巾、毛巾、襪子中的回收率如表2 所示，均在74.620%-108.781%之間。

表1 農藥標準品交叉反應率Table1 Cross-reaction rates of pesticide standards

表2 三種紡織品中回收率的測定Table2 Recovery rate of three textiles

3 結語

本實驗采用間接競爭酶聯免疫法建立了一種快速高效檢測紡織品中有機磷農藥的方法，所采用的三組抗原抗體靈敏度高，結果滿足國家檢出標準。其中三唑磷、對硫磷組抗原抗體特異性強，與其它農藥無交叉反應。而甲基對硫磷抗原抗體也能識別對硫磷農藥，可能是由于甲基對硫磷與對硫磷是相似度更高的同系物，從而也產生較多程度的識別?；诖?，本試驗不僅為開發(fā)有機磷類農藥的廣譜性抗體提供了依據，并且可以滿足紡織品中有機磷農藥的快速高效測定。