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        酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定紡織品中的有機(jī)磷農(nóng)藥

        2020-12-21 03:18:06岳婭東尹盈愛(ài)白樺張慶董益陽(yáng)
        商品與質(zhì)量 2020年45期
        關(guān)鍵詞:三唑有機(jī)磷緩沖液

        岳婭東 尹盈愛(ài) 白樺 張慶 董益陽(yáng)

        1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京 100029

        2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100124

        隨著社會(huì)不斷地進(jìn)步與發(fā)展,人們漸漸對(duì)服裝的需求不再僅是保暖、舒服,還希望其更健康、環(huán)保。但由于在農(nóng)作物生長(zhǎng)期間反復(fù)使用農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑[1],導(dǎo)致紡織品從原料源頭到加工成成品的過(guò)程中都可能存在農(nóng)藥殘留,而有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥是紡織品中主要?dú)埩舻霓r(nóng)藥[2]。殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人體健康的危害巨大。據(jù)統(tǒng)計(jì),農(nóng)藥中毒有75.4%歸因于有機(jī)磷農(nóng)藥[3]。有機(jī)磷農(nóng)藥可通過(guò)經(jīng)皮吸收等方式進(jìn)入人體,隨后會(huì)出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀,會(huì)產(chǎn)生嘔吐、惡心、視力模糊、呼吸困難等現(xiàn)象,甚至死亡[4]。因此,《生態(tài)紡織品技術(shù)要求》對(duì)紡織品中對(duì)硫磷等60 種農(nóng)藥殘留量做出了明確規(guī)定,要求嬰兒產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量不超過(guò)0.5mg/kg,非嬰兒產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量不超過(guò)1.0mg/kg[5]。

        傳統(tǒng)的檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法等儀器分析法,此類(lèi)方法不僅成本高、對(duì)操作人員要求較高且樣品前處理步驟繁瑣[6]。相較于大型儀器檢測(cè)方法,快速檢測(cè)技術(shù)具有便捷輕巧,成本低廉等優(yōu)勢(shì),且能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),目前主要包括免疫分析法、酶抑制法及生物傳感器技術(shù)等[7-9]。免疫分析法主要利用抗原與抗體的反應(yīng),進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的定性和定量檢測(cè),其優(yōu)點(diǎn)是成本低,周期短。本文所采用的就是免疫分析法中比較有代表性的技術(shù)——酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),此方法常被用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析中[10]。

        本試驗(yàn)以三唑磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷為研究對(duì)象,利用識(shí)別這三種農(nóng)藥的特異性單克隆抗體,建立并優(yōu)化了酶聯(lián)免疫的間接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法,為快速、經(jīng)濟(jì)、高效檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥提供了一種新手段。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器、試劑與材料

        三唑磷抗原、對(duì)硫磷抗原、甲基對(duì)硫磷抗原、三唑磷抗體、對(duì)硫磷抗體、甲基對(duì)硫磷的鼠源抗體,HRP(辣根過(guò)氧化物酶)-羊抗鼠IgG 羊抗鼠-HRP 酶標(biāo)二抗;多種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于北京信方源生物科技有限公司;口水巾、毛巾、襪子均購(gòu)自北京天豐利市場(chǎng);配制:包被液(0.05M PBS,pH9.6)、稀釋液(0.01M PBS,pH7.4)、洗滌緩沖液(0.01M PBST;pH7.4,0.05% 吐溫-20)、封閉液(3%的牛血清蛋白)、過(guò)氧化物酶底物TMB 顯色A、B 液、終止液(2M H2SO4)。

        8 通道排槍、電子天平、超純水器、PH 計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、混勻儀、酶標(biāo)儀、恒溫冰箱、96 孔透明酶標(biāo)板、移液槍、超聲振蕩儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        (1)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法(Indirect Competition ELISA,ic-ELISA)檢測(cè)原理及操作步驟:

        原理:包被在酶標(biāo)板上的抗原與有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體,反應(yīng)后形成抗原-抗體復(fù)合物。若標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥濃度低,與包被抗原結(jié)合的抗體就多,反之亦然。加入酶標(biāo)二抗后用底物液顯色。顯色越淺,吸光度會(huì)越小,抑制率越高,則抗體的特異性越強(qiáng)。

        步驟:用包被緩沖液將抗原稀釋到最佳濃度,每孔100μL加入96 孔板中,37℃恒溫2 小時(shí);用移液槍吸取PBST,每孔200μL,加入96 孔板中洗滌3 次;加入封閉液每孔200μL,37℃恒溫2 小時(shí);PBST 洗板3 次;用稀釋緩沖液將有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋好,每孔加50μL,再加入稀釋好的抗體每孔50μL,搖勻后在37℃下靜置30min;PBST 洗板3 次;將稀釋好的酶標(biāo)二抗加入96 孔板中,每孔100μL,37℃下靜置30min;PBST 洗板3 次;將底液A 、B 按1:1 比例混合均勻,每孔100μL 加入96 孔板中,37℃下靜置20min;吸取終止液每孔100μL 加入酶標(biāo)板中;用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm 下進(jìn)行讀數(shù),即為OD450 值。

        (2)抗原、抗體的最佳工作濃度-棋盤(pán)法。酶標(biāo)二抗的濃度參考說(shuō)明書(shū)用稀釋緩沖液稀釋為5000 倍。用包被緩沖液和稀釋緩沖液分別將抗原抗體進(jìn)行梯度稀釋后,類(lèi)似棋盤(pán)式設(shè)計(jì),在酶標(biāo)板上不加校準(zhǔn)物,進(jìn)行直接ELISA。在450nm 讀取吸光度。選擇OD450 ≈1.5 為抗原抗體最佳工作濃度。

        (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及交叉反應(yīng)率。將所用的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋 為1ppb、5ppb、10ppb、50ppb、100ppb、200ppb, 依 據(jù)IC-ELISA 的步驟;將酶標(biāo)板的第一行設(shè)為空白組,即所加農(nóng)藥為0ppb,最后一行設(shè)為對(duì)照組,即不加農(nóng)藥和一抗,用PBS 來(lái)代替以保證與實(shí)驗(yàn)組的體積相同,在波長(zhǎng)450nm 處讀取各吸光度值。重復(fù)上述三次,取各平均值,分析數(shù)據(jù)并計(jì)算得出抑制率(%)=[(OD 空白組-OD 實(shí)驗(yàn)組)/(OD 空白組-OD 對(duì)照組)]×100%,擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)曲線(xiàn)擬合得到方程,抑制率50%時(shí)為半數(shù)抑制濃度IC50,抑制率15%時(shí)為檢出限IC15。

        交叉反應(yīng)率(Cross Reaction,CR)反映受檢物質(zhì)在干擾物存在下的特異性,交叉反應(yīng)率越低,抗體特異性越強(qiáng)。用受檢物質(zhì)的IC50 除以干擾物的IC50,即為對(duì)照濃度的交叉反應(yīng)率,即交叉反應(yīng)率(%)=(受檢物質(zhì)的IC50/干擾物的IC50)×100%。

        (4)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)?;厥章适菣z驗(yàn)ELISA 方法是否實(shí)際可行的一項(xiàng)重要數(shù)據(jù),可通過(guò)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)得到回收率數(shù)據(jù)。一般認(rèn)為回收率在70%-120%時(shí),檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠。分別把口水巾、毛巾、襪子洗凈用超純水浸泡過(guò)夜,烘干后取純白色無(wú)印花部分1g,剪成5mm×5mm,放入50mL 離心管混勻;加入2μL 的三唑磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥原液(100μg/mL),室溫靜置15min;在離心管中加入20mL 乙酸乙酯,超聲20min,將提取液濾出;殘?jiān)儆?0mL 乙酸乙酯超聲5min,將兩次濾液合并。將濾液在40℃水浴旋蒸濃縮至干,殘留物用1mL5%的甲醇-PBS 溶解,即得200ng/mL 的加標(biāo)樣品用于測(cè)定。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

        將三唑磷組抗原抗體分別稀釋?zhuān)?000,10000,15000,20000,25000,30000,40000 倍;對(duì)硫磷組抗原抗體分別稀釋為:2000,4000,5000,8000,10000,12000,15000,16000倍;甲基對(duì)硫磷組抗原和抗體分別稀釋為:2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,10000 倍。測(cè)得吸光度如圖1-3。選擇OD450 ≈1.5 時(shí),三唑磷組、對(duì)硫磷組、甲基對(duì)硫磷組抗原抗體的最佳工作稀釋倍數(shù)分別都是:10000、5000、2000。

        圖1 三唑磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure1 Triazophos concentration optimization

        圖2 對(duì)硫磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure2 Parathion concentration optimization

        圖3 甲基對(duì)硫磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure3 Methyl parathion concentration optimization

        2.2 靈敏度和特異性

        用三唑磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷此三對(duì)抗原抗體在本試驗(yàn)最佳工作濃度下進(jìn)行ic-ELISA,測(cè)定結(jié)果采用logistic 模型擬合四參數(shù)方程,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4-6 所示。三唑磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷的檢出限IC15 分別為:2.621ng/mL、3.357ng/mL、2.780ng/mL;半數(shù)抑制濃度IC50 值分別為:28.468ng/mL、37.787ng/mL、64.185ng/mL。

        圖4 三唑磷農(nóng)藥與三唑磷抗原抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure4 Standard curve of triazophos pesticide and triazophos antigen antibody

        本試驗(yàn)分別用多種結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)磷農(nóng)藥作為干擾物質(zhì)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn),交叉反應(yīng)率如表1 所示。三唑磷、對(duì)硫磷組特異性良好,甲基對(duì)硫磷組抗原抗體可識(shí)別對(duì)硫磷農(nóng)藥,其檢出限為3.230ng/mL,半數(shù)抑制濃度為99.566ng/mL,交叉反應(yīng)率為64.465%。

        圖5 對(duì)硫磷農(nóng)藥與對(duì)硫磷抗原抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure5 Standard curve of parathion pesticide and parathion antigen antibody

        圖6 對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥與甲基對(duì)硫磷抗原抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure6 Standard curve of parathion,methyl parathion pesticides and methyl parathion antigen antibody

        2.3 回收率

        取制備好的加標(biāo)樣品替代農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行IC-ELISA 測(cè)定,三唑磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷這三種農(nóng)藥在口水巾、毛巾、襪子中的回收率如表2 所示,均在74.620%-108.781%之間。

        表1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品交叉反應(yīng)率Table1 Cross-reaction rates of pesticide standards

        表2 三種紡織品中回收率的測(cè)定Table2 Recovery rate of three textiles

        3 結(jié)語(yǔ)

        本實(shí)驗(yàn)采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法建立了一種快速高效檢測(cè)紡織品中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法,所采用的三組抗原抗體靈敏度高,結(jié)果滿(mǎn)足國(guó)家檢出標(biāo)準(zhǔn)。其中三唑磷、對(duì)硫磷組抗原抗體特異性強(qiáng),與其它農(nóng)藥無(wú)交叉反應(yīng)。而甲基對(duì)硫磷抗原抗體也能識(shí)別對(duì)硫磷農(nóng)藥,可能是由于甲基對(duì)硫磷與對(duì)硫磷是相似度更高的同系物,從而也產(chǎn)生較多程度的識(shí)別?;诖?,本試驗(yàn)不僅為開(kāi)發(fā)有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥的廣譜性抗體提供了依據(jù),并且可以滿(mǎn)足紡織品中有機(jī)磷農(nóng)藥的快速高效測(cè)定。

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