岳婭東 尹盈愛 白樺 張慶 董益陽

1.北京化工大學生命科學與技術(shù)學院 北京 100029

2.中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100124

隨著社會不斷地進步與發(fā)展，人們漸漸對服裝的需求不再僅是保暖、舒服，還希望其更健康、環(huán)保。但由于在農(nóng)作物生長期間反復使用農(nóng)藥殺蟲劑[1]，導致紡織品從原料源頭到加工成成品的過程中都可能存在農(nóng)藥殘留，而有機磷類農(nóng)藥是紡織品中主要殘留的農(nóng)藥[2]。殘留的有機磷農(nóng)藥對人體健康的危害巨大。據(jù)統(tǒng)計，農(nóng)藥中毒有75.4%歸因于有機磷農(nóng)藥[3]。有機磷農(nóng)藥可通過經(jīng)皮吸收等方式進入人體，隨后會出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，會產(chǎn)生嘔吐、惡心、視力模糊、呼吸困難等現(xiàn)象，甚至死亡[4]。因此，《生態(tài)紡織品技術(shù)要求》對紡織品中對硫磷等60 種農(nóng)藥殘留量做出了明確規(guī)定，要求嬰兒產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量不超過0.5mg/kg，非嬰兒產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量不超過1.0mg/kg[5]。

傳統(tǒng)的檢測有機磷農(nóng)藥的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法等儀器分析法，此類方法不僅成本高、對操作人員要求較高且樣品前處理步驟繁瑣[6]。相較于大型儀器檢測方法，快速檢測技術(shù)具有便捷輕巧，成本低廉等優(yōu)勢，且能實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，目前主要包括免疫分析法、酶抑制法及生物傳感器技術(shù)等[7-9]。免疫分析法主要利用抗原與抗體的反應(yīng)，進行有機磷農(nóng)藥的定性和定量檢測，其優(yōu)點是成本低，周期短。本文所采用的就是免疫分析法中比較有代表性的技術(shù)——酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA），此方法常被用于有機磷農(nóng)藥殘留的檢測分析中[10]。

本試驗以三唑磷、甲基對硫磷、對硫磷為研究對象，利用識別這三種農(nóng)藥的特異性單克隆抗體，建立并優(yōu)化了酶聯(lián)免疫的間接競爭檢測方法，為快速、經(jīng)濟、高效檢測有機磷農(nóng)藥提供了一種新手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

三唑磷抗原、對硫磷抗原、甲基對硫磷抗原、三唑磷抗體、對硫磷抗體、甲基對硫磷的鼠源抗體，HRP（辣根過氧化物酶）-羊抗鼠IgG 羊抗鼠-HRP 酶標二抗；多種有機磷農(nóng)藥標準品購買于北京信方源生物科技有限公司；口水巾、毛巾、襪子均購自北京天豐利市場；配制：包被液（0.05M PBS，pH9.6）、稀釋液（0.01M PBS，pH7.4）、洗滌緩沖液（0.01M PBST；pH7.4，0.05% 吐溫-20）、封閉液（3%的牛血清蛋白）、過氧化物酶底物TMB 顯色A、B 液、終止液（2M H2SO4）。

8 通道排槍、電子天平、超純水器、PH 計、離心機、恒溫水浴鍋、混勻儀、酶標儀、恒溫冰箱、96 孔透明酶標板、移液槍、超聲振蕩儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實驗方法

（1）間接競爭酶聯(lián)免疫法（Indirect Competition ELISA，ic-ELISA）檢測原理及操作步驟：

原理：包被在酶標板上的抗原與有機磷標準品或樣品中的有機磷農(nóng)藥競爭特異性抗體，反應(yīng)后形成抗原-抗體復合物。若標準品或樣品中的有機磷農(nóng)藥濃度低，與包被抗原結(jié)合的抗體就多，反之亦然。加入酶標二抗后用底物液顯色。顯色越淺，吸光度會越小，抑制率越高，則抗體的特異性越強。

步驟：用包被緩沖液將抗原稀釋到最佳濃度，每孔100μL加入96 孔板中，37℃恒溫2 小時；用移液槍吸取PBST，每孔200μL，加入96 孔板中洗滌3 次；加入封閉液每孔200μL，37℃恒溫2 小時；PBST 洗板3 次；用稀釋緩沖液將有機磷農(nóng)藥標準品按梯度稀釋好，每孔加50μL，再加入稀釋好的抗體每孔50μL，搖勻后在37℃下靜置30min；PBST 洗板3 次；將稀釋好的酶標二抗加入96 孔板中，每孔100μL，37℃下靜置30min；PBST 洗板3 次；將底液A 、B 按1：1 比例混合均勻，每孔100μL 加入96 孔板中，37℃下靜置20min；吸取終止液每孔100μL 加入酶標板中；用酶標儀在波長450nm 下進行讀數(shù)，即為OD450 值。

（2）抗原、抗體的最佳工作濃度-棋盤法。酶標二抗的濃度參考說明書用稀釋緩沖液稀釋為5000 倍。用包被緩沖液和稀釋緩沖液分別將抗原抗體進行梯度稀釋后，類似棋盤式設(shè)計，在酶標板上不加校準物，進行直接ELISA。在450nm 讀取吸光度。選擇OD450 ≈1.5 為抗原抗體最佳工作濃度。

（3）標準曲線及交叉反應(yīng)率。將所用的農(nóng)藥標準品分別稀釋 為1ppb、5ppb、10ppb、50ppb、100ppb、200ppb， 依 據(jù)IC-ELISA 的步驟；將酶標板的第一行設(shè)為空白組，即所加農(nóng)藥為0ppb，最后一行設(shè)為對照組，即不加農(nóng)藥和一抗，用PBS 來代替以保證與實驗組的體積相同，在波長450nm 處讀取各吸光度值。重復上述三次，取各平均值，分析數(shù)據(jù)并計算得出抑制率（%）=[（OD 空白組-OD 實驗組）/（OD 空白組-OD 對照組）]×100%，擬合標準曲線。根據(jù)曲線擬合得到方程，抑制率50%時為半數(shù)抑制濃度IC50，抑制率15%時為檢出限IC15。

交叉反應(yīng)率（Cross Reaction，CR）反映受檢物質(zhì)在干擾物存在下的特異性，交叉反應(yīng)率越低，抗體特異性越強。用受檢物質(zhì)的IC50 除以干擾物的IC50，即為對照濃度的交叉反應(yīng)率，即交叉反應(yīng)率（%）=（受檢物質(zhì)的IC50/干擾物的IC50）×100%。

（4）加標實驗。回收率是檢驗ELISA 方法是否實際可行的一項重要數(shù)據(jù)，可通過加標實驗得到回收率數(shù)據(jù)。一般認為回收率在70%-120%時，檢測方法準確可靠。分別把口水巾、毛巾、襪子洗凈用超純水浸泡過夜，烘干后取純白色無印花部分1g，剪成5mm×5mm，放入50mL 離心管混勻；加入2μL 的三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷農(nóng)藥原液（100μg/mL），室溫靜置15min；在離心管中加入20mL 乙酸乙酯，超聲20min，將提取液濾出；殘渣再用10mL 乙酸乙酯超聲5min，將兩次濾液合并。將濾液在40℃水浴旋蒸濃縮至干，殘留物用1mL5%的甲醇-PBS 溶解，即得200ng/mL 的加標樣品用于測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件優(yōu)化

將三唑磷組抗原抗體分別稀釋：5000，10000，15000，20000，25000，30000，40000 倍；對硫磷組抗原抗體分別稀釋為：2000，4000，5000，8000，10000，12000，15000，16000倍；甲基對硫磷組抗原和抗體分別稀釋為：2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，10000 倍。測得吸光度如圖1-3。選擇OD450 ≈1.5 時，三唑磷組、對硫磷組、甲基對硫磷組抗原抗體的最佳工作稀釋倍數(shù)分別都是：10000、5000、2000。

圖1 三唑磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure1 Triazophos concentration optimization

圖2 對硫磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure2 Parathion concentration optimization

圖3 甲基對硫磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure3 Methyl parathion concentration optimization

2.2 靈敏度和特異性

用三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷此三對抗原抗體在本試驗最佳工作濃度下進行ic-ELISA，測定結(jié)果采用logistic 模型擬合四參數(shù)方程，標準曲線如圖4-6 所示。三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷的檢出限IC15 分別為：2.621ng/mL、3.357ng/mL、2.780ng/mL；半數(shù)抑制濃度IC50 值分別為：28.468ng/mL、37.787ng/mL、64.185ng/mL。

圖4 三唑磷農(nóng)藥與三唑磷抗原抗體標準曲線Figure4 Standard curve of triazophos pesticide and triazophos antigen antibody

本試驗分別用多種結(jié)構(gòu)相似的有機磷農(nóng)藥作為干擾物質(zhì)進行特異性實驗，交叉反應(yīng)率如表1 所示。三唑磷、對硫磷組特異性良好，甲基對硫磷組抗原抗體可識別對硫磷農(nóng)藥，其檢出限為3.230ng/mL，半數(shù)抑制濃度為99.566ng/mL，交叉反應(yīng)率為64.465%。

圖5 對硫磷農(nóng)藥與對硫磷抗原抗體標準曲線Figure5 Standard curve of parathion pesticide and parathion antigen antibody

圖6 對硫磷、甲基對硫磷農(nóng)藥與甲基對硫磷抗原抗體標準曲線Figure6 Standard curve of parathion，methyl parathion pesticides and methyl parathion antigen antibody

2.3 回收率

取制備好的加標樣品替代農(nóng)藥標準品進行IC-ELISA 測定，三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷這三種農(nóng)藥在口水巾、毛巾、襪子中的回收率如表2 所示，均在74.620%-108.781%之間。

表1 農(nóng)藥標準品交叉反應(yīng)率Table1 Cross-reaction rates of pesticide standards

表2 三種紡織品中回收率的測定Table2 Recovery rate of three textiles

3 結(jié)語

本實驗采用間接競爭酶聯(lián)免疫法建立了一種快速高效檢測紡織品中有機磷農(nóng)藥的方法，所采用的三組抗原抗體靈敏度高，結(jié)果滿足國家檢出標準。其中三唑磷、對硫磷組抗原抗體特異性強，與其它農(nóng)藥無交叉反應(yīng)。而甲基對硫磷抗原抗體也能識別對硫磷農(nóng)藥，可能是由于甲基對硫磷與對硫磷是相似度更高的同系物，從而也產(chǎn)生較多程度的識別?；诖?，本試驗不僅為開發(fā)有機磷類農(nóng)藥的廣譜性抗體提供了依據(jù)，并且可以滿足紡織品中有機磷農(nóng)藥的快速高效測定。