岳婭東 尹盈愛(ài) 白樺 張慶 董益陽(yáng)

1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京 100029

2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100124

隨著社會(huì)不斷地進(jìn)步與發(fā)展，人們漸漸對(duì)服裝的需求不再僅是保暖、舒服，還希望其更健康、環(huán)保。但由于在農(nóng)作物生長(zhǎng)期間反復(fù)使用農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑[1]，導(dǎo)致紡織品從原料源頭到加工成成品的過(guò)程中都可能存在農(nóng)藥殘留，而有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥是紡織品中主要?dú)埩舻霓r(nóng)藥[2]。殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人體健康的危害巨大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，農(nóng)藥中毒有75.4%歸因于有機(jī)磷農(nóng)藥[3]。有機(jī)磷農(nóng)藥可通過(guò)經(jīng)皮吸收等方式進(jìn)入人體，隨后會(huì)出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，會(huì)產(chǎn)生嘔吐、惡心、視力模糊、呼吸困難等現(xiàn)象，甚至死亡[4]。因此，《生態(tài)紡織品技術(shù)要求》對(duì)紡織品中對(duì)硫磷等60 種農(nóng)藥殘留量做出了明確規(guī)定，要求嬰兒產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量不超過(guò)0.5mg/kg，非嬰兒產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量不超過(guò)1.0mg/kg[5]。

傳統(tǒng)的檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法等儀器分析法，此類(lèi)方法不僅成本高、對(duì)操作人員要求較高且樣品前處理步驟繁瑣[6]。相較于大型儀器檢測(cè)方法，快速檢測(cè)技術(shù)具有便捷輕巧，成本低廉等優(yōu)勢(shì)，且能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，目前主要包括免疫分析法、酶抑制法及生物傳感器技術(shù)等[7-9]。免疫分析法主要利用抗原與抗體的反應(yīng)，進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的定性和定量檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)是成本低，周期短。本文所采用的就是免疫分析法中比較有代表性的技術(shù)——酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA），此方法常被用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析中[10]。

本試驗(yàn)以三唑磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷為研究對(duì)象，利用識(shí)別這三種農(nóng)藥的特異性單克隆抗體，建立并優(yōu)化了酶聯(lián)免疫的間接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法，為快速、經(jīng)濟(jì)、高效檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥提供了一種新手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

三唑磷抗原、對(duì)硫磷抗原、甲基對(duì)硫磷抗原、三唑磷抗體、對(duì)硫磷抗體、甲基對(duì)硫磷的鼠源抗體，HRP（辣根過(guò)氧化物酶）-羊抗鼠IgG 羊抗鼠-HRP 酶標(biāo)二抗；多種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于北京信方源生物科技有限公司；口水巾、毛巾、襪子均購(gòu)自北京天豐利市場(chǎng)；配制：包被液（0.05M PBS，pH9.6）、稀釋液（0.01M PBS，pH7.4）、洗滌緩沖液（0.01M PBST；pH7.4，0.05% 吐溫-20）、封閉液（3%的牛血清蛋白）、過(guò)氧化物酶底物TMB 顯色A、B 液、終止液（2M H2SO4）。

8 通道排槍、電子天平、超純水器、PH 計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、混勻儀、酶標(biāo)儀、恒溫冰箱、96 孔透明酶標(biāo)板、移液槍、超聲振蕩儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法（Indirect Competition ELISA，ic-ELISA）檢測(cè)原理及操作步驟：

原理：包被在酶標(biāo)板上的抗原與有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，反應(yīng)后形成抗原-抗體復(fù)合物。若標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥濃度低，與包被抗原結(jié)合的抗體就多，反之亦然。加入酶標(biāo)二抗后用底物液顯色。顯色越淺，吸光度會(huì)越小，抑制率越高，則抗體的特異性越強(qiáng)。

步驟：用包被緩沖液將抗原稀釋到最佳濃度，每孔100μL加入96 孔板中，37℃恒溫2 小時(shí)；用移液槍吸取PBST，每孔200μL，加入96 孔板中洗滌3 次；加入封閉液每孔200μL，37℃恒溫2 小時(shí)；PBST 洗板3 次；用稀釋緩沖液將有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋好，每孔加50μL，再加入稀釋好的抗體每孔50μL，搖勻后在37℃下靜置30min；PBST 洗板3 次；將稀釋好的酶標(biāo)二抗加入96 孔板中，每孔100μL，37℃下靜置30min；PBST 洗板3 次；將底液A 、B 按1：1 比例混合均勻，每孔100μL 加入96 孔板中，37℃下靜置20min；吸取終止液每孔100μL 加入酶標(biāo)板中；用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm 下進(jìn)行讀數(shù)，即為OD450 值。

（2）抗原、抗體的最佳工作濃度-棋盤(pán)法。酶標(biāo)二抗的濃度參考說(shuō)明書(shū)用稀釋緩沖液稀釋為5000 倍。用包被緩沖液和稀釋緩沖液分別將抗原抗體進(jìn)行梯度稀釋后，類(lèi)似棋盤(pán)式設(shè)計(jì)，在酶標(biāo)板上不加校準(zhǔn)物，進(jìn)行直接ELISA。在450nm 讀取吸光度。選擇OD450 ≈1.5 為抗原抗體最佳工作濃度。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及交叉反應(yīng)率。將所用的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋 為1ppb、5ppb、10ppb、50ppb、100ppb、200ppb， 依 據(jù)IC-ELISA 的步驟；將酶標(biāo)板的第一行設(shè)為空白組，即所加農(nóng)藥為0ppb，最后一行設(shè)為對(duì)照組，即不加農(nóng)藥和一抗，用PBS 來(lái)代替以保證與實(shí)驗(yàn)組的體積相同，在波長(zhǎng)450nm 處讀取各吸光度值。重復(fù)上述三次，取各平均值，分析數(shù)據(jù)并計(jì)算得出抑制率（%）=[（OD 空白組-OD 實(shí)驗(yàn)組）/（OD 空白組-OD 對(duì)照組）]×100%，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)曲線(xiàn)擬合得到方程，抑制率50%時(shí)為半數(shù)抑制濃度IC50，抑制率15%時(shí)為檢出限IC15。

交叉反應(yīng)率（Cross Reaction，CR）反映受檢物質(zhì)在干擾物存在下的特異性，交叉反應(yīng)率越低，抗體特異性越強(qiáng)。用受檢物質(zhì)的IC50 除以干擾物的IC50，即為對(duì)照濃度的交叉反應(yīng)率，即交叉反應(yīng)率（%）=（受檢物質(zhì)的IC50/干擾物的IC50）×100%。

（4）加標(biāo)實(shí)驗(yàn)?；厥章适菣z驗(yàn)ELISA 方法是否實(shí)際可行的一項(xiàng)重要數(shù)據(jù)，可通過(guò)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)得到回收率數(shù)據(jù)。一般認(rèn)為回收率在70%-120%時(shí)，檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠。分別把口水巾、毛巾、襪子洗凈用超純水浸泡過(guò)夜，烘干后取純白色無(wú)印花部分1g，剪成5mm×5mm，放入50mL 離心管混勻；加入2μL 的三唑磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥原液（100μg/mL），室溫靜置15min；在離心管中加入20mL 乙酸乙酯，超聲20min，將提取液濾出；殘?jiān)儆?0mL 乙酸乙酯超聲5min，將兩次濾液合并。將濾液在40℃水浴旋蒸濃縮至干，殘留物用1mL5%的甲醇-PBS 溶解，即得200ng/mL 的加標(biāo)樣品用于測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

將三唑磷組抗原抗體分別稀釋?zhuān)?000，10000，15000，20000，25000，30000，40000 倍；對(duì)硫磷組抗原抗體分別稀釋為：2000，4000，5000，8000，10000，12000，15000，16000倍；甲基對(duì)硫磷組抗原和抗體分別稀釋為：2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，10000 倍。測(cè)得吸光度如圖1-3。選擇OD450 ≈1.5 時(shí)，三唑磷組、對(duì)硫磷組、甲基對(duì)硫磷組抗原抗體的最佳工作稀釋倍數(shù)分別都是：10000、5000、2000。

圖1 三唑磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure1 Triazophos concentration optimization

圖2 對(duì)硫磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure2 Parathion concentration optimization

圖3 甲基對(duì)硫磷組抗原抗體濃度優(yōu)化Figure3 Methyl parathion concentration optimization

2.2 靈敏度和特異性

用三唑磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷此三對(duì)抗原抗體在本試驗(yàn)最佳工作濃度下進(jìn)行ic-ELISA，測(cè)定結(jié)果采用logistic 模型擬合四參數(shù)方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4-6 所示。三唑磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷的檢出限IC15 分別為：2.621ng/mL、3.357ng/mL、2.780ng/mL；半數(shù)抑制濃度IC50 值分別為：28.468ng/mL、37.787ng/mL、64.185ng/mL。

圖4 三唑磷農(nóng)藥與三唑磷抗原抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure4 Standard curve of triazophos pesticide and triazophos antigen antibody

本試驗(yàn)分別用多種結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)磷農(nóng)藥作為干擾物質(zhì)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，交叉反應(yīng)率如表1 所示。三唑磷、對(duì)硫磷組特異性良好，甲基對(duì)硫磷組抗原抗體可識(shí)別對(duì)硫磷農(nóng)藥，其檢出限為3.230ng/mL，半數(shù)抑制濃度為99.566ng/mL，交叉反應(yīng)率為64.465%。

圖5 對(duì)硫磷農(nóng)藥與對(duì)硫磷抗原抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure5 Standard curve of parathion pesticide and parathion antigen antibody

圖6 對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥與甲基對(duì)硫磷抗原抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure6 Standard curve of parathion，methyl parathion pesticides and methyl parathion antigen antibody

2.3 回收率

取制備好的加標(biāo)樣品替代農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行IC-ELISA 測(cè)定，三唑磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷這三種農(nóng)藥在口水巾、毛巾、襪子中的回收率如表2 所示，均在74.620%-108.781%之間。

表1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品交叉反應(yīng)率Table1 Cross-reaction rates of pesticide standards

表2 三種紡織品中回收率的測(cè)定Table2 Recovery rate of three textiles

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法建立了一種快速高效檢測(cè)紡織品中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，所采用的三組抗原抗體靈敏度高，結(jié)果滿(mǎn)足國(guó)家檢出標(biāo)準(zhǔn)。其中三唑磷、對(duì)硫磷組抗原抗體特異性強(qiáng)，與其它農(nóng)藥無(wú)交叉反應(yīng)。而甲基對(duì)硫磷抗原抗體也能識(shí)別對(duì)硫磷農(nóng)藥，可能是由于甲基對(duì)硫磷與對(duì)硫磷是相似度更高的同系物，從而也產(chǎn)生較多程度的識(shí)別?；诖?，本試驗(yàn)不僅為開(kāi)發(fā)有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥的廣譜性抗體提供了依據(jù)，并且可以滿(mǎn)足紡織品中有機(jī)磷農(nóng)藥的快速高效測(cè)定。