牛興杰， 劉志慧， 崔鳳梅， 劉耀敏， 王艷飛， 張國(guó)民， 劉金霞

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染性疾病科， 河北 承德 067000； 2 承德醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河北 承德 067000

慢性乙型肝炎(CHB)的發(fā)病機(jī)制涉及多種炎性細(xì)胞之間的相互作用[1]。肝纖維化是肝硬化的早期可逆轉(zhuǎn)階段，目前學(xué)者研究[2]證實(shí)，在肝纖維化發(fā)展至早期肝硬化階段，若能得到及時(shí)的診斷和治療，肝纖維化甚至早期肝硬化仍是可逆的。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt，同時(shí)不編碼蛋白質(zhì)的一種RNA。研究[3]顯示，lncRNA參與細(xì)胞各種生命活動(dòng)的不同階段，并認(rèn)為其幾乎參與到涉及生命周期的每一個(gè)過(guò)程。在一些復(fù)雜疾病中，相關(guān)信號(hào)通常來(lái)源于基因的非編碼區(qū)域，目前研究[4]證實(shí)，lncRNA異常表達(dá)與人類重大疾病相關(guān)，如心血管疾病、各種癌癥、阿爾茨海默病等，lncRNA作為潛在的診斷、治療及預(yù)后指標(biāo)，受到了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。本研究探討分析外周血lncRNA-LET對(duì)CHB肝硬化的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究為前瞻性研究，選取2017年3月-2019年5月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的CHB患者183例，其中乙型肝炎肝硬化患者作為肝硬化組，無(wú)肝硬化病理改變患者作為非肝硬化組。同時(shí)，選擇同期在本院健康體檢的40例健康人群作為正常對(duì)照組。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)CHB患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[5]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)CHB患者均未進(jìn)行抗病毒治療；(3)納入受試者自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他肝炎病毒感染者，如HAV、HCV、HDV；(2)合并其他特殊病毒感染者，包括巨細(xì)胞病毒、EB病毒以及HIV等；(3)合并酒精性肝病以及非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病以及藥物性肝損傷患者；(4)合并原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌以及合并其他器官腫瘤患者；(5)合并風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病，與免疫功能異常相關(guān)其他疾病等。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 肝功能檢測(cè) 取3組受試者清晨空腹靜脈血2 ml，離心分離血清，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，采用放射免疫測(cè)定3組受試者肝功能指標(biāo)，包括TBil、膽堿酯酶(ChE)、總膽汁酸(TBA)以及Alb。

1.3.2 外周血lncRNA-LET水平檢測(cè) 取3組受試者空腹靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，離心分離血清，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩？俁NA提取：取出樣品解凍后加入Trizol試劑，混勻后加入氯仿，震蕩，離心后取上層無(wú)色液體，加入異丙醇混勻后離心，棄去上清，加入焦碳酸二乙酯溶解。逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA：參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：參照熒光定量PCR試劑盒使用說(shuō)明書，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s變性、58 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸，共完成35個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線分析PCR產(chǎn)物，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取3個(gè)孔平均值，以GAPDH作為內(nèi)參基因，以2-△△Ct表示相對(duì)表達(dá)量。lncRNA-LET上下游引物分別為：5′-GTTGTTGTTGCATTGGG-3′，5′-AAGATGGAGAGTGGAGCCT-3′。

1.3.3 肝組織學(xué)檢查 若有嚴(yán)重并發(fā)癥無(wú)法進(jìn)行肝穿刺活檢患者，根據(jù)影像學(xué)及臨床診斷確診，其余患者進(jìn)行肝穿刺活檢，其中共有156例患者接受組織學(xué)檢查。受檢查在B超定位下，采用16G肝穿刺經(jīng)皮負(fù)壓針吸活檢，吸取肝組織，樣本使用10%甲醛固定，石蠟包埋切片，對(duì)切片進(jìn)行HE染色、Masson三色染色，病理診斷結(jié)果由3位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師閱片。按照《慢性病毒性肝炎臨床與病理的診斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]纖維化分期(S)標(biāo)準(zhǔn)將肝纖維化程度分為S0～S4五期，S4級(jí)為早期肝硬化或肯定的肝硬化。對(duì)于合并嚴(yán)重凝血功能異常、大量腹水等無(wú)法進(jìn)行肝穿刺活檢患者，根據(jù)影像學(xué)及臨床診斷，確診為肝硬化，則作為S4期。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2016HL008?；颊呔橥?。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計(jì)量資料采用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。等級(jí)資料組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析外周血lncRNA-LET對(duì)肝硬化的預(yù)測(cè)價(jià)值。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入CHB患者175例，其中男101例、女74例，肝硬化組52例(代償期患者39例、失代償期患者13例)，非肝硬化組123例。3組受試者性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，非肝硬化組患者與肝硬化組患者HBV DNA比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而肝硬化組患者HBeAg陽(yáng)性及活動(dòng)性CHB比例均顯著高于非肝硬化組(P值均<0.05)(表1)。

2.2 3組受試者肝功能指標(biāo)比較 肝硬化患者和非肝硬化患者血清肝功能指標(biāo)TBil、TBA、Alb以及ALT均顯著高于正常對(duì)照組，而血清ChE顯著低于正常對(duì)照組(P值均<0.05)；肝硬化患者血清肝功能指標(biāo)TBil、TBA、Alb以及ALT均顯著高于非肝硬化患者(P值均<0.05)，血清ChE顯著低于非肝硬化患者(P值均<0.05)(表2)。在肝硬化患者中，Chid-Pugh分級(jí)A級(jí)21例、B級(jí)18例、C級(jí)13例。

2.3 3組受試者外周血lncRNA-LET水平比較 肝硬化組患者與非肝硬化組患者外周血lncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組(P值均<0.05)，其中肝硬化組患者外周血lncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量顯著低于非肝硬化患者(P<0.05)(表3)。

2.4 CHB患者不同纖維化分期外周血lncRNA-LET水平比較 根據(jù)CHB患者纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)，S0期患者16例、S1期患者25例、S2期患者47例、S3期患者35例、S4期患者52例。隨著患者肝纖維化分期的增加，lncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P值均<0.05)(表4)。

表3 3組受試者外周血lncRNA-LET水平比較

表4 CHB患者不同纖維化分期外周血lncRNA-LET水平比較

2.5 CHB患者外周血lncRNA-LET與肝纖維分期、肝功能的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CHB患者外周血lncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量與肝纖維化分期、TBil、TBA、Alb、ALT呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.352、-0.372、-0.364、-0.410，P值均<0.001)，與ChE呈正相關(guān)(r=0.340，P<0.001)。

2.6 CHB患者外周血lncRNA-LET對(duì)肝硬化的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析外周血lncRNA-LET對(duì)肝硬化的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積為0.934，最佳截?cái)嘀禐?.833，敏感度為84.57%，特異度為80.57%(圖1)。

表1 3組受試者一般資料比較

表2 3組受試者肝功能指標(biāo)比較

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)過(guò)程，晚期肝纖維化的持續(xù)存在常?？蓪?dǎo)致肝硬化甚至原發(fā)性肝癌的發(fā)生[6]。目前越來(lái)越多的研究認(rèn)為，肝纖維化甚至早期肝硬化是可逆的[7]，因此對(duì)于肝硬化的診斷成為學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。肝硬化作為慢性肝炎發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，大部分肝癌的病理生理過(guò)程均與肝硬化的演變密切相關(guān)。既然肝硬化與肝癌之間的發(fā)生發(fā)展具有著密切的聯(lián)系，那么在肝硬化的早期階段對(duì)疾病進(jìn)行干預(yù)，逆轉(zhuǎn)肝硬化病程的進(jìn)展，對(duì)于阻止肝癌的發(fā)生發(fā)展成為新的可能[8]。肝硬化的發(fā)生及發(fā)展作為一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涵蓋了肝細(xì)胞的壞死凋亡、間充質(zhì)細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積破壞等過(guò)程，因此有學(xué)者[9-10]提出，可能存在具有差異性表達(dá)的lncRNA可通過(guò)影響肝細(xì)胞凋亡以及間充質(zhì)細(xì)胞增殖等過(guò)程從而影響肝硬化疾病進(jìn)程。

lncRNA是一類長(zhǎng)度在200個(gè)核苷酸以上的RNA分子，隨著目前新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，在各類生物體中均發(fā)生大量具有生物學(xué)功能的lncRNA[11]。目前研究[12-13]顯示，lncRNA廣泛參與生物體內(nèi)多種重要的生理病理過(guò)程，可以從觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)方面對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控。在肝硬化不同階段均伴隨著肝臟炎癥損傷、細(xì)胞凋亡以及損傷后修復(fù)等過(guò)程，在不同階段細(xì)胞損傷凋亡都有所不同，lncRNA對(duì)肝硬化的調(diào)控機(jī)制，可能與調(diào)控肝細(xì)胞凋亡、間充質(zhì)細(xì)胞增殖等有關(guān)[14]。目前有研究[15]報(bào)道顯示，lncRNA-LET在肝癌患者中出現(xiàn)異常表達(dá)，而鑒于肝硬化與肝癌之間的密切聯(lián)系，筆者推測(cè)是否可將lncRNA-LET作為CHB肝硬化的診斷指標(biāo)，從而為患者診斷及干預(yù)提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，肝硬化組與非肝硬化組患者外周血lncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組(P值均<0.05)；肝硬化組患者外周血lncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量顯著低于非肝硬化患者(P<0.05)。提示在乙型肝炎患者中可出現(xiàn)lncRNA-LET表達(dá)量的降低，且肝硬化患者lncRNA-LET表達(dá)量更低。有報(bào)道[16-17]顯示，在肝癌組織中l(wèi)ncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織顯著降低，本研究進(jìn)一步證實(shí)，在CHB向肝硬化甚至肝癌發(fā)展進(jìn)程中具有差異性表達(dá)。針對(duì)患者肝纖維化進(jìn)程進(jìn)行l(wèi)ncRNA-LET表達(dá)水平的比較，結(jié)果顯示，隨著患者肝纖維化分期的增加，lncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，CHB患者外周血lncRNA-LET相對(duì)表達(dá)量與肝纖維化分期呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.352，P<0.001)。提示隨著肝纖維化進(jìn)程的發(fā)展，患者外周血lncRNA-LET表達(dá)量明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA-LET異常表達(dá)與患者肝纖維化進(jìn)程明顯相關(guān)?；谏鲜鲅芯?，發(fā)現(xiàn)lncRNA-LET與CHB肝硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而是否可以將其作為患者肝硬化的診斷指標(biāo)之一，研究采用ROC曲線分析其診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積為0.934，最佳截?cái)嘀禐?.833，提示lncRNA-LET對(duì)CHB肝硬化具有良好的診斷價(jià)值。但是由于本研究納入樣本量較小，且僅針對(duì)患者外周血lncRNA-LET水平與疾病進(jìn)程進(jìn)行分析，有關(guān)lncRNA-LET對(duì)肝硬化的調(diào)控機(jī)制，仍需要進(jìn)一步深入研究分析；此外，本研究缺乏lncRNA-LET與其他血清學(xué)診斷方式的比較，下一步研究還需與各種常用血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析或聯(lián)合運(yùn)用，以更好地指導(dǎo)臨床工作。

綜上所述，外周血lncRNA-LET隨著CHB肝纖維化進(jìn)程的發(fā)展，其表達(dá)水平有所降低，且對(duì)CHB肝硬化具有較好的診斷價(jià)值，可成為肝硬化診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：牛興杰、劉志慧、劉耀敏負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；劉志慧、王艷飛、張國(guó)民參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；崔鳳梅、劉金霞等負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。