王 姣， 田元元， 梁志軍

1 海南省人民醫(yī)院， 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院 a. 感染科； b. 消化內(nèi)科， ?？?570311；2 博鰲超級(jí)醫(yī)院 感染科， 海南 瓊海 571435

直接抗病毒藥物(DAA)的問世使慢性丙型肝炎的治療進(jìn)入了治愈的時(shí)代，但HCV感染慢性化機(jī)制尚未完全闡明。輔助性T淋巴細(xì)胞9(Th9)是新鑒定的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，主要分泌IL-9，PU.1和Foxo1是誘導(dǎo)Th9分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[1-2]。Th9在病毒感染中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用[3]，但Th9及其分泌的IL-9在HCV感染中的作用尚未完全闡明。因此，本研究分析了慢性丙型肝炎患者Th9水平及其與相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系，觀察抗病毒對(duì)慢性丙型肝炎患者Th9水平的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年12月-2019年7月于海南省人民醫(yī)院就診的慢性丙型肝炎初治患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲且<65歲；(2)HCV RNA和抗-HCV陽性6個(gè)月以上；(3)入組前未使用抗病毒或免疫調(diào)節(jié)劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)影像學(xué)(腹部B超、肝纖維化掃描、CT或MRI)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查綜合評(píng)估診斷為肝硬化；(2)合并其他嗜肝病毒和(或)HIV感染；(3)合并惡性腫瘤；(4)合并心臟、肺、肝臟、腎臟等重要臟器功能不全；(5)合并自身免疫性疾??；(6)孕婦及哺乳期婦女。所有入組患者均接受索磷布韋維帕他韋片(每片含有索磷布韋400 mg和維帕他韋100 mg，吉列德科學(xué)公司)1片/d口服治療，療程12周。同時(shí)，選取同期本院進(jìn)行健康體檢的健康志愿者作為對(duì)照組。

1.2 病毒學(xué)和生化檢測 采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測血清HCV RNA，試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供，檢測閾值為100拷貝/ml。采用日本Hitachi公司7170A全自動(dòng)生化分析儀檢測患者肝功能，ALT參考范圍為男性12～40 U/L，女性11～35 U/L。

1.3 血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離 慢性丙型肝炎患者基線和抗病毒治療結(jié)束時(shí)分別采集EDTA抗凝外周血10 ml，室溫1000 r/min離心10 min收集上層血漿，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｏ聦友?xì)胞使用美國Sigma公司的人淋巴細(xì)胞分離液、采用密度梯度離心法分離PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度至107個(gè)/ml，凍存于液氮中備用。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞分泌IL-9水平 復(fù)蘇凍存的PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度至106個(gè)/ml，加入佛波酯(50 ng/ml)和伊烏諾霉素(1 μg/ml)刺激細(xì)胞因子分泌，同時(shí)加入莫能霉素(10 μg/ml)抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，刺激培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入FACS管中，加入抗CD3-PerCP(美國BD公司)、抗CD4-FITC(美國BD公司)、抗CD8-APC(美國BD公司)進(jìn)行表面染色，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后加入破膜固定液，4 ℃避光孵育15 min后加入抗IL-9-PE(美國eBioscience公司)，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后加入4%多聚甲醛/PBS固定細(xì)胞，使用美國BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀、采用CellQuest Pro軟件獲取細(xì)胞，采用美國TreeStar公司FlowJo V10軟件分析結(jié)果。

1.5 ELISA檢測IL-9水平 使用武漢碧云天公司的IL-9 ELISA檢測試劑盒檢測血漿IL-9水平。將血清樣本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以100 μl/孔加入檢測平板中，封住反應(yīng)孔，室溫孵育2 h，洗板5次后加入100 μl/孔生物素化抗體，封住反應(yīng)孔，室溫孵育1 h，洗板5次后加入100 μl/孔辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin，封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20 min，洗板5次后加入100 μl/孔TMB顯色劑，封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育15 min，帶標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)顯著顏色變化時(shí)加入50 μl/孔終止液，混勻后立即測量A450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿中IL-9濃度。

1.6 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR法檢測PBMC中IL-9、PU.1和Foxo1 mRNA水平 應(yīng)用德國Qiagen公司RNA提取試劑盒提取PBMC中總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系(TaKaRa公司PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒)：5×緩沖液 2 μl，反轉(zhuǎn)錄酶混合物I 0.5 μl，寡聚胸腺嘧啶引物 0.5 μl，隨機(jī)六核苷酸引物 0.5 μl，總RNA 1 μg，加入不含RNA酶的去離子水調(diào)整反應(yīng)體積至10 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系(TaKaRa公司TB Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒)：TB Green預(yù)混Taq酶 10 μl，ROX參考染料 0.4 μl，上游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，下游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，cDNA 2 μl，滅菌水 6.8 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。PCR引物序列：IL-9上游引物：5’-CCAGCTTCC AAGTGCCACTGC-3’，IL-9下游引物：5’-TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG-3’；PU.1上游引物：5’-GGAAGCCCGGCTGGATGTTAC-3’，PU.1下游引物：5’-CACCAGGTCTTCTGA TGGCTGA-3’；Foxo1上游引物：5’-ACAGACCAACCTGGCATTAC-3’；Foxo1下游引物：5’-TACGTCCTGATGGGACTTACA-3’；β-肌動(dòng)蛋白上游引物：5’-CACGAAACTACCTTC AACTCC-3’，β-肌動(dòng)蛋白下游引物：5’-CATACTCCTGCTTGCTGAATC-3’。采用2-ΔΔCt法以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照對(duì)IL-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.7 倫理學(xué)審查 本研究方案通過海南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：省醫(yī)倫審[2018]91，入組志愿者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入29例慢性丙型肝炎初治患者，其中9例基線ALT正常，20例基線ALT超過正常值上限，所有患者均完成了12周抗病毒治療，治療結(jié)束時(shí)均達(dá)到病毒學(xué)應(yīng)答(HCV RNA低于檢測下限)，所有患者ALT水平均復(fù)常。同時(shí)納入年齡和性別比例相匹配的健康對(duì)照者15例，兩組基線臨床特征見表1。

表1 兩組基線臨床特征

2.2 兩組Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 慢性丙型肝炎初治患者和健康對(duì)照者外周血Th9(CD3+CD4+IL-9+)典型流式散點(diǎn)圖見圖1，慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9占CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯低于健康對(duì)照者(P<0.05)(表2)。慢性丙型肝炎初治患者血漿IL-9水平、IL-9 mRNA和PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量亦明顯低于健康對(duì)照者(P值均<0.05)，但Foxo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在慢性丙型肝炎初治患者和健康對(duì)照者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。而Th9比例、血漿IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在HCV基因1b型患者和2a型患者之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

2.3 慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA和PU.1 mRNA與HCV RNA呈負(fù)相關(guān)(P值均<0.05)(圖2)，但Foxo1 mRNA與HCV RNA無明顯相關(guān)性(P>0.05)，上述指標(biāo)與ALT水平均無明顯相關(guān)性(P值均>0.05)。

表2 兩組Th9比例、IL-9水平和IL-9 mRNA、PU.1 mRNA及Foxo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.4 抗病毒治療對(duì)慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA及PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 所有患者完成12周抗病毒治療后外周血Th9比例和PU.1 mRNA均明顯高于基線(P值均<0.05)(表3)，但I(xiàn)L-9水平和IL-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量在基線和治療結(jié)束時(shí)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。

表3 抗病毒治療對(duì)慢性丙型肝炎初治患者Th9比例、IL-9水平、IL-9 mRNA及PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

Th9是一種多效性的輔助性淋巴細(xì)胞，可能通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮免疫保護(hù)和促進(jìn)疾病進(jìn)展的雙重作用[4-5]。Th9及其分泌的IL-9在多種病毒感染性疾病中均發(fā)揮重要作用。在寨卡病毒感染的早期，Th9即被活化，分泌IL-9水平顯著升高，病程至恢復(fù)期時(shí)Th9和IL-9水平復(fù)常[6]，而Th9的活化可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞損傷密切相關(guān)[7]。Th9和IL-9在急性和慢性HIV感染中表現(xiàn)出完全不同的表達(dá)譜，急性HIV感染IL-9水平顯著升高，而慢性HIV感染中IL-9水平顯著下降[8]。本研究首次檢測了慢性丙型肝炎初治患者Th9及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎初治患者外周血Th9細(xì)胞比例、IL-9水平及IL-9 mRNA和PU.1 mRNA水平均顯著降低，且與HCV病毒載量呈顯著負(fù)相關(guān)。這與在慢性乙型肝炎患者中的研究[9]結(jié)果一致，提示高水平的病毒復(fù)制可能抑制了Th9的活化和IL-9的分泌，同時(shí)，由于Th9和IL-9水平與ALT無顯著相關(guān)性，提示Th9可能與慢性丙型肝炎初治患者的炎癥應(yīng)答無關(guān)，Th9和IL-9水平降低可能不足以發(fā)揮免疫保護(hù)作用，進(jìn)而誘導(dǎo)感染慢性化。Th9比例和IL-9水平在不同HCV基因型之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，Th9和IL-9水平的降低可能與不同HCV基因型慢性丙型肝炎患者對(duì)治療敏感性的差異無關(guān)。PU.1和Foxo1均為誘導(dǎo)Th9分化的重要轉(zhuǎn)錄因子， PU.1是特異性誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-9的細(xì)胞因子，而Foxo1不但可誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-9，還可抑制Th17和CD8+T淋巴細(xì)胞的分化及IL-9的分泌。因此，F(xiàn)oxo1并非特異性Th9的轉(zhuǎn)錄因子[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Foxo1 mRNA水平在慢性丙型肝炎初治患者和健康對(duì)照者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Foxo1可能并非調(diào)控HCV感染者中Th9的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而PU.1可能是主要發(fā)揮調(diào)控HCV感染者中Th9分化和活化的作用。

DAA治療可有效控制HCV復(fù)制，在絕大多數(shù)慢性丙型肝炎患者中應(yīng)用后均可達(dá)到治愈。新近研究[12]發(fā)現(xiàn)，DAA治療對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答也具有調(diào)控作用。DAA治療不但可恢復(fù)急性丙型肝炎患者HCV特異性免疫應(yīng)答，還可降低慢性丙型肝炎患者外泌體相關(guān)microRNA水平，進(jìn)而增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的脫顆粒，促進(jìn)殺傷功能[13]，以索磷布韋為基礎(chǔ)的有效抗病毒治療可抑制多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，抑制HCV誘導(dǎo)的肝臟炎癥[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)索磷布韋/維帕他韋有效抗病毒治療后，所有患者均獲得病毒學(xué)應(yīng)答，Th9和PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較基線均顯著下降，但血漿IL-9水平和IL-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量在基線和治療后的則無差異。由于Th9并非分泌IL-9的唯一細(xì)胞來源，多種免疫細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞、固有淋巴樣細(xì)胞2、漿細(xì)胞)均可分泌IL-9[4]，DAA治療可能無法有效恢復(fù)其他分泌IL-9的免疫細(xì)胞功能，導(dǎo)致IL-9水平無明顯變化，這與慢性乙型肝炎患者經(jīng)恩替卡韋抗病毒治療后IL-9水平無顯著變化的結(jié)果一致[15]。但DAA治療則可有效恢復(fù)慢性HCV感染者外周血Th9活性，發(fā)揮一定的免疫調(diào)控作用。

綜上所述，慢性HCV感染可能抑制Th9活化，有效的抗病毒治療可恢復(fù)Th9水平，Th9可能參與了HCV感染慢性化。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：王姣、田元元負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施，收集數(shù)據(jù)，入組患者，撰寫論文。梁志軍負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，修改論文。王姣負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。