楊晴柔 陳芝蕓 何蓓暉 葉 蕾 嚴(yán)峻彬 嚴(yán)茂祥#

1 紹興市第七人民醫(yī)院 浙江 紹興 312000

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

肝纖維化（HF）是多種慢性肝病的最常見病理特征，可進(jìn)展為肝硬化，最終導(dǎo)致肝癌。肝纖維化尚有逆轉(zhuǎn)的可能，因此，尋找有效地抗肝纖維藥物，具有重要的臨床意義。中醫(yī)藥在抗肝纖維化方面具有獨特的優(yōu)勢和巨大潛力；其抗肝纖維化的機(jī)制包括調(diào)控多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，抑制肝臟炎癥，抗脂質(zhì)過氧化損傷，抑制肝星狀細(xì)胞（HSCs）的活化和增殖，調(diào)節(jié)纖維化因子的合成和分泌，以及調(diào)節(jié)合成和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解等[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[2]。補腎化瘀方是課題組多年用于治療肝纖維化的中藥復(fù)方，前期機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，該方能通過調(diào)控Hh信號通路、TGF-β1/smad3信號通路等的異常激活，抑制肝臟炎癥和HSC的活化，抗肝纖維化進(jìn)展[3-4]。為了進(jìn)一步探討補腎化瘀方抗纖維化的“多途徑”多環(huán)節(jié)”“多靶點”作用機(jī)制，本研究觀察該方對四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化大鼠肝組織Hippo信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物：SD雄性大鼠40只，SPF級，體重140±10g，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK(滬)2013-0016］；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗造模。

1.2 藥物與試劑：補腎化瘀方由仙靈脾、女貞子、黃精、黨參、虎杖、丹參、郁金、積雪草（比例1.25∶1.25∶1.67∶1.25∶2∶2.5∶1∶1.25）等組成，由本院制劑室制成流浸膏。CCl4（批號：20140319）由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供；總RNA提取試劑（批號：AK1703）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（A140832A）、TB Green熒光定量 PCR試劑（批號：AH80345A）為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；總蛋白提取試劑盒（批號：20190425）為江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；10%TGX Stain-FreeTMFastCastTMAcrylamide Kit（批號：64096791）為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，BCA定量試劑盒（批號：A90723）、GAPDH鼠單克隆抗體（批號：A85370844）、Potent ECL試劑盒（批號：A82610615）為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；Mst1兔單克隆抗體（產(chǎn)品號：14946S、Yap鼠單克隆抗體（產(chǎn)品號：12395S）、Phospho-Yap兔單克隆抗體（產(chǎn)品號：13008S）為美國CST公司產(chǎn)品；CTGF鼠單克隆抗體（批號：C096）為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器：生物樣品均質(zhì)器（法國Bertin Technologies），核酸蛋白分析儀（英國柏精BioDrop）；全波長酶標(biāo)儀（美國Bio-TeK）；熒光定量PCR儀（美國BIORAD）、垂直電泳及半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國BIO-RAD）；雙近紅外分子成像系統(tǒng)（美國LI-COR）。

1.4 實驗方法：40只大鼠按每組8只隨機(jī)分對照組、模型組、BYHYF低劑量組、BYHYF劑量組、BYHYF高劑量組5組。對照組每周2次用橄欖油按3mL/Kg體重皮下注射，其他4組以40%CCl4(V/V，以橄欖油配制成)按3mL/Kg體重皮下注射，每周2次，首次加倍，均連續(xù)6周；在造模的同時，BYHYF低、中、高劑量組分別按11、22、44mg/（Kg體重·d）進(jìn)行灌胃，連續(xù)6周；正常對照組和肝纖維化模型組則灌服等容量的0.9%NaCl，連續(xù)6周；所有大鼠予以普通大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。末次給藥次日大鼠空腹3%戊巴比妥鈉尾部靜脈注射麻醉下處死大鼠并分離肝臟，部分肝組織10%中性甲醛固定后常規(guī)HE和Masson染色，觀察肝組織炎癥和纖維化；部分投入液氮中凍存，2～3h后移入-80℃冰箱用于基因和蛋白檢測。Mst1、Yap、CTGF的mRNA的表達(dá)采用qRT-PCR技術(shù)，以β-actin為內(nèi)參，相對表達(dá)量（2-ΔΔCt）表示目標(biāo)基因相對表達(dá)量，引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計并合成，Mst上游引物：5’-TGAAGAGCTGGACTGTGGAGGAC-3，下游引物5’-GGATTGGCTGCCGCTTGGAG-3’，擴(kuò)增片段：114bp；Yap上游引物：5’-GCCATGAACCAGAGGATCACTCAG-3’,下激引物：5’-AGCCTCTCCTTCTCCATCTGTAGC-3’；擴(kuò)增片段152bp;CTGF上游引物：5’-CACCGCACAGAACCACCACAC-3’，下游引物：5’-GGCAGGCACAGGTCTTGATGAAC-3’，擴(kuò)增片段96bp；β-actin上游引物：5’-TGTTGCCCTAGACTTCGAGCA-3’，下 游 引 物 5’-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3’，擴(kuò)增片段155bp。采用全蛋白抽提試劑盒提取肝組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，Western blot技術(shù)檢測Mst1、Yap和CTGF蛋白表達(dá)及Yap的磷酸化表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織病理影響：HE和Masson染色發(fā)現(xiàn)對照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞從中央靜脈呈索狀排列，膠原著色僅見于血管壁；模型組大鼠肝組織大量炎細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞脂肪變，小葉內(nèi)肝細(xì)胞廣泛壞死灶，膠原纖維增生進(jìn)入小葉達(dá)中央靜脈周圍，小葉結(jié)構(gòu)紊亂；與模型組比，BSHYF低、中、高劑量組大鼠肝組織炎細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死有不同程度改善，纖維結(jié)締組織沉積顯著減少，見圖1。

2.2 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織Mst1、Yap、CTGF基因mRNA表達(dá)的影響：模型組大鼠肝組織Mst1mRNA和Yap mRNA較對照組分別有下降和上調(diào)趨勢，但均差異無顯著性（P＞0.05）；BSHYF低、中、高劑量組Mst1 mRNA和Yap mRNA較模型組分別有上調(diào)和下降趨勢，但差異無顯著性（P＞0.05）。模型組CTGF mRNA表達(dá)較對照組顯著升高（P＜0.01），BSHYF中、高劑量組大鼠CTGF mRNA表達(dá)較模型組顯著下調(diào)（P＜0.01）。見圖2。

圖1 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織病理影響

圖2 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織Mst1、Yap、CTGF基因mRNA表達(dá)的影響

2.3 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織Mst1、Yap、CTGF蛋白表達(dá)的影響：模型組大鼠肝組織Mst1蛋白表達(dá)較對照組顯著下降（P＜0.01），BSHYF高劑量組Mst1蛋白表達(dá)較模型組顯著上調(diào)（P＜0.01）；模型組大鼠肝組織Yap、CTGF、蛋白表達(dá)較對照組顯著上升（P＜0.01），BSHYF低、中、高劑量組Yap、CTGF蛋白表達(dá)較模型組顯著下降（P＜0.01）；模型組大鼠肝組織Yap磷酸化水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），BSHYF低、中、高劑量組較模型組p-Yap磷酸化表達(dá)有上調(diào)趨勢，但差異并無顯著性（P＞0.05）。見圖3。

圖3 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織Mst1、Yap、CTGF蛋白表達(dá)的影響

3 討論

補腎化瘀方是課題組根據(jù)肝纖維化“本虛標(biāo)實”的病機(jī)特點提出的治療慢性肝纖維化的中藥復(fù)方，具有補腎健脾以扶正，理氣化瘀解毒以驅(qū)邪的功效，前期的研究已表明，該方改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織炎癥和纖維化程度，保護(hù)肝細(xì)胞，防止肝纖維化進(jìn)展[3-4]。本研究進(jìn)一步從Hippo信號通路探討其療效的作用機(jī)制。

近年來研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路可通過影響HSCs的轉(zhuǎn)分化、增殖和凋亡，進(jìn)而影響肝纖維化的發(fā)生及進(jìn)展[5]。Mst1是該途徑上游信號的核心組成部分，也是維持正常肝細(xì)胞狀態(tài)的必要條件[6]。正常肝組織中Hippo通路的激活源于對Mst1磷酸化。磷酸化Mst1能直接磷酸化Lats1/2外，還能分別與支架蛋白Sav1、銜接蛋白Mob1結(jié)合間接促發(fā)Lats1/2磷酸化?；罨腖ats1/2磷酸化Yap中的絲氨酸殘基，導(dǎo)致p-Yap（Ser127）與14-3-3結(jié)合，使Yap泛素化、降解，阻礙Yap由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的途徑，使Yap保留在細(xì)胞質(zhì)中；位于細(xì)胞質(zhì)中的Yap不能與核內(nèi)TEAD結(jié)合，從而抑制了Yap轉(zhuǎn)錄活性[7]。當(dāng)Hippo信號通路被抑制時，未磷酸化Yap可由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)積聚；移位至核內(nèi)的Yap本身不與DNA結(jié)合，它可與多個轉(zhuǎn)錄因子（如TEAD）相互作用以驅(qū)動靶基因（如CTGF）表達(dá)[8]。Tadanors[9]等人發(fā)現(xiàn)Yap介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生與Yap-TEAD介導(dǎo)的CTGF轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。多項研究發(fā)現(xiàn)Yap在HSCs早期活化期間出現(xiàn)大量細(xì)胞核內(nèi)積累，抑制Yap可阻止HSCs纖維化生成[10]。CTGF是Yap下游效應(yīng)因子，降低CTGF的表達(dá)可抑制HSCs的增殖與遷移[11]。因此，Hippo信號通路中Yap核質(zhì)穿梭是調(diào)節(jié)TEAD活性，控制CTGF表達(dá)的關(guān)鍵；而CTGF也被認(rèn)為是Yap在肝纖維化中的直接靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化模型組大鼠肝組織中Mst1蛋白表達(dá)較正常對照組明顯下降（P＜0.01），Yap蛋白、CTGF mRNA及蛋白表達(dá)較對照組有明顯上升（P＜0.05，P＜0.01），推測在早期肝損狀態(tài)下，Hippo信號通路中上游信號Mst1對p-Yap的作用可能被抑制，促使Hippo信號通路激活，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。應(yīng)用補腎化瘀方干預(yù)后，高劑量組Mst1蛋白表達(dá)較模型組增強（P＜0.01），低、中、高劑量組Yap、CTGF蛋白表達(dá)以及中、高劑量組CTGF mRNA表達(dá)較模型組顯著下降（P＜0.01），結(jié)合我們前期研究，發(fā)現(xiàn)不同劑量的補腎化瘀方能抑制肝纖維化大鼠肝組織α-SMA表達(dá)和HSCs的活化[3]。研究表明，補腎化瘀方對Hippo的上游信號Mst1、Yap的促進(jìn)作用使得對核內(nèi)靶基因的激活作用增強，這一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致Hippo信號通路的活化被抑制和纖維化程度被減弱。綜上所述，補腎化瘀方可能對Hippo/Yap信號通路的激活起到抑制作用，進(jìn)而抑制HSCs的活化，這可能是該方抗肝纖維化的作用機(jī)制之一。