潘曉芳 吳靜標(biāo) 黃燕虹 朱秀霞 黃鴻新

維生素D 是人體必需的一類脂溶性類固醇衍生物，經(jīng)兩次羥基化后與細(xì)胞內(nèi)維生素D 受體（Vitamin D receptor，VDR）特異性結(jié)合后，發(fā)揮其生理作用。維生素D 缺乏會(huì)引起骨骼系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、糖代謝、細(xì)胞增殖分化、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腫瘤等相關(guān)疾病。血清25-羥基維生素D（25-hydroxyvitamin D，25-OH VD）濃度被認(rèn)為是測(cè)定全面維生素D 狀態(tài)的最可靠指標(biāo)［1-3］，因而可用于測(cè)定患者是否出現(xiàn)維生素D 缺乏?！毒S生素D 及其類似物臨床應(yīng)用共識(shí)》指出：血清25-OH VD 水平檢測(cè)已被公認(rèn)為反映維生素D 狀態(tài)的最合理指標(biāo)［2］。全球范圍內(nèi)有很多人25-OH VD 缺乏，因此定期檢測(cè)25-OH VD 水平確保其充足對(duì)疾病預(yù)防意義重大［4-6］。本文綜述了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光分析法、酶聯(lián)免疫法、克隆酶供體免疫測(cè)定法、免疫層析法、膠乳免疫比濁法共6 種檢測(cè)25-OH VD 的方法，并對(duì)各個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)和不足進(jìn)行分析，以期為臨床選擇25-OH VD 的檢驗(yàn)方法提供指導(dǎo)。

1 我國(guó)25-OH VD 檢測(cè)試劑盒注冊(cè)情況

《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》將25-OH VD檢測(cè)試劑盒分為第二類［7］。截止2020年11月30日，檢索國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（以下簡(jiǎn)稱國(guó)家局）國(guó)產(chǎn)醫(yī)療器械數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)25-OH VD 檢測(cè)試劑盒涉及的方法學(xué)主要包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光分析法、酶聯(lián)免疫法、克隆酶供體免疫測(cè)定法、免疫層析法、膠乳免疫比濁法。

2 25-OH VD 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法及其原理

2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）

LC-MS/MS 的原理是利用被檢測(cè)物質(zhì)25-OH VD2/D3 與背景干擾物如基質(zhì)中的其他內(nèi)源性物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離。待測(cè)樣本經(jīng)過(guò)色譜柱分離后流出，進(jìn)入質(zhì)譜離子源離子化，形成不同質(zhì)荷比的氣相帶電離子。在電場(chǎng)的作用下，帶電離子進(jìn)入Q1 四極桿質(zhì)量分析器，目標(biāo)母離子被特定電場(chǎng)選擇出來(lái)，通過(guò)Q1 四極桿，進(jìn)入Q2 碰撞池，在碰撞氣體（氬氣）和一定碰撞電壓的作用下，目標(biāo)母離子被打碎成若干子離子。這些子離子進(jìn)入Q3 四極桿質(zhì)量分析器后，在特定電場(chǎng)作用下，只有目標(biāo)子離子被選擇出來(lái)，能通過(guò)Q3 四極桿，進(jìn)入檢測(cè)器中進(jìn)行檢測(cè)。整個(gè)掃描過(guò)程中目標(biāo)分析物離子經(jīng)過(guò)兩次選擇后，特異性和靈敏度可大大提高，最后得到對(duì)稱性良好的色譜峰。通過(guò)色譜峰的時(shí)間和峰面積等信息可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量處理。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，由于樣品中摻入了同位素標(biāo)記的25-OH VD2/D3，能夠很好地消除基質(zhì)效應(yīng)，其分析準(zhǔn)確度優(yōu)于外標(biāo)法。另外，LC-MS/MS 法能夠有效區(qū)分25-OH VD2/D3，比免疫法靈敏度更高，是臨床檢測(cè)維生素D 的金標(biāo)準(zhǔn)［2，8-10］。

研究表明，LC-MS/MS 法測(cè)定干血點(diǎn)、血漿、血清樣本中的25-OH VD2/D3，具有靈敏度高、分析快速、準(zhǔn)確性好、儀器穩(wěn)定等特點(diǎn)［11-12］。鄭仁錦等［13］利用乙腈提取、飽和硫酸鋅沉淀蛋白、然后用正己烷萃取的方法建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法-同位素標(biāo)記快速測(cè)定血清25-OH VD3 的方法，該方法用于美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院NIST972a 質(zhì)控樣品及實(shí)際樣品中25-OH VD的測(cè)定，獲得了滿意的結(jié)果。廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司聯(lián)合廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院通過(guò)引入自動(dòng)化取樣平臺(tái)、前處理平臺(tái)、更換色譜柱、將單通道液相改為多通道液相系統(tǒng)等措施將LC-MS/MS 法檢測(cè)25-OH VD 過(guò)程中樣本取樣環(huán)節(jié)檢測(cè)效率提升了21%，樣本前處理環(huán)節(jié)檢測(cè)效率提升了74%，以及液相分離環(huán)節(jié)檢測(cè)效率提升了63%［14］。

為了促進(jìn)維生素D 標(biāo)準(zhǔn)化工作，2010年維生素D 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃（The Vitamin D Standardization Program，VDSP）啟動(dòng)，VDSP 通過(guò)建立參考測(cè)量體系給美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院（The National Institute of Standards and Technology，NIST）提供標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)（Standard Reference Materials，SRM），從而促進(jìn)全球包括商業(yè)化和自建方法在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室25-OH VD 檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化［15-16］。NIST 和比利時(shí)根特大學(xué)建立了同位素LC-MS/MS 法定量測(cè)定血清中25-OH VD2、25-OH VD3 的參考方法，得到了檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會(huì)（The Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）的認(rèn)可［17-19］。但是LC-MS/MS 法儀器昂貴，安裝條件嚴(yán)格，需要較大場(chǎng)地方可滿足要求；樣本前處理復(fù)雜，檢測(cè)通量比較低，比較難適應(yīng)臨床大批量樣本的需求；手工操作比較復(fù)雜，操作人員需要經(jīng)過(guò)比較專業(yè)的培訓(xùn)，難以推廣；盡管被公認(rèn)為檢測(cè)25-OH VD 的金標(biāo)準(zhǔn)，LC-MS/MS 法仍然易受3-epi-25OH-D3 和3-epi-25OH-D2 等異構(gòu)體的交叉影響，尤其對(duì)嬰幼兒的檢測(cè)易出現(xiàn)假陽(yáng)性［20-23］。另外，由于色譜和質(zhì)譜條件等未標(biāo)準(zhǔn)化，不同實(shí)驗(yàn)室之間的處理方法和色譜條件等不同，對(duì)同一個(gè)體也會(huì)產(chǎn)生不同的臨床評(píng)價(jià)。

截至2020年11月30日，國(guó)內(nèi)已經(jīng)取得注冊(cè)證的LC-MS/MS 法測(cè)定25-OH VD2/D3 的試劑盒廠家有廣州可力質(zhì)譜醫(yī)療器械有限公司、廣州豐華生物工程有限公司、上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司等10 家公司。根據(jù)查詢數(shù)據(jù)可知，以上廠家都是2019 和2020年獲得的注冊(cè)證，各家在色譜和質(zhì)譜條件上也各有差異，因此要將LC-MS/MS法標(biāo)準(zhǔn)化，國(guó)內(nèi)亟需解決25-OH VD 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的制備工作。

2.2 免疫法

已注冊(cè)的產(chǎn)品設(shè)計(jì)原理主要為競(jìng)爭(zhēng)法。

2.2.1 化學(xué)發(fā)光分析法（Chemiluminescence Immunoassay，ECLIA）

涉及的檢測(cè)試劑盒按其發(fā)光機(jī)理具體可分為直接化學(xué)發(fā)光法、酶促化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法［24］。

張旋等［25］對(duì)雅培全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定25-OH VD 的檢測(cè)性能進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)估，與LC-MS/MS 法的檢測(cè)結(jié)果比較表明，雅培全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀可以滿足臨床檢測(cè)的要求。邢晏等［26］利用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)驗(yàn)證血清25-OH VD試劑盒的性能指標(biāo)，結(jié)果表明ECLIA 檢測(cè)25-OH VD 具有檢測(cè)周期短、靈敏度和自動(dòng)化程度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。卜玲等［27］建立了一種25-OH VD 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，通過(guò)檢測(cè)抗體-抗原衍生物-磁珠的復(fù)合物的光信號(hào)來(lái)測(cè)定樣本中25-OH VD 的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此方法具有省時(shí)、快速、穩(wěn)定性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠克服ELISA 法結(jié)果受反應(yīng)時(shí)間、溫度、加樣等因素的影響。目前，化學(xué)發(fā)光分析法雖然靈敏度高，但是其檢測(cè)成本較高，且需要特定的化學(xué)發(fā)光儀，導(dǎo)致其在25-OH VD 的臨床檢測(cè)中應(yīng)用范圍較小。

2.2.2 酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

ELISA 一般采用競(jìng)爭(zhēng)法原理對(duì)樣本中的25-OH VD 進(jìn)行定量檢測(cè)。該法在臨床上雖然還保有一定的使用量，但因操作繁瑣，已很少有公司再繼續(xù)開(kāi)發(fā)。

ELISA 和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差隨著25-OH VD 濃度的升高而減?。?8］。武姍姍［29］應(yīng)用SPSS 軟件比較LC-MS/MS、ECLIA 以及ELISA 兩兩方法測(cè)定血清25-OH VD 結(jié)果的相關(guān)性和一致性，結(jié)果顯示25-OH VD2 含量極低時(shí)，三種方法測(cè)定血清25-OH VD 呈高度正相關(guān)，LC-MS/MS 和ELISA 之間的結(jié)果一致性良好。

截至2020年11月30日，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)拿到注冊(cè)證的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)25-OH VD 或25-OH VD3 的試劑盒有廣州菲康生物技術(shù)有限公司、北京正旦國(guó)際科技有限責(zé)任公司等6 家公司。

2.2.3 克隆酶供體免疫測(cè)定法（Cloned Enzyme Donor Immunoassay，CDEIA）

CDEIA 又叫酶供體競(jìng)爭(zhēng)法，基于β-半乳糖苷酶α-互補(bǔ)性原理，利用DNA 重組技術(shù)制備酶受體（Enzyme Accept，EA）和酶供體（Enzyme Donor，ED）兩個(gè)片段的β-半乳糖苷酶。EA 和ED 只有在合適條件下結(jié)合在才具有酶活性，利用EA 和ED特性建立的均相酶免測(cè)定稱為CDEIA。CDEIA 同樣采用競(jìng)爭(zhēng)法原理進(jìn)行檢測(cè)，ED 標(biāo)記的25-OH VD 抗原與其特異性抗體結(jié)合后由于空間位阻不能再與EA 結(jié)合形成具有活性的β-半乳糖苷酶。反應(yīng)平衡后，剩余的ED 標(biāo)記25-OH VD 抗原與EA 結(jié)合形成具有活性的酶，加入底物測(cè)定酶活力，酶活力的大小與樣本總25-OH VD 抗原標(biāo)本含量成正比，通過(guò)特定波長(zhǎng)的吸光度變化值，可以得出25-OH VD 的濃度。

上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司的“25-羥基維生素D 測(cè)定試劑盒（克隆酶供體免疫測(cè)定法）”是國(guó)內(nèi)首個(gè)在全自動(dòng)生化儀上用于檢測(cè)血清樣本中25-OH VD 的試劑盒，比市場(chǎng)同類產(chǎn)品有一定優(yōu)勢(shì)，操作簡(jiǎn)便，其檢測(cè)結(jié)果與英國(guó)Immunodiagnostic Systems Limited 公司生產(chǎn)的試劑檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性良好，各項(xiàng)分析性能完全能夠達(dá)到指標(biāo)要求，可為臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)［30］。

2.2.4 熒光免疫層析法（Fluorescence Immunochromatography Asaay，F(xiàn)ICA）

熒光免疫層析技術(shù)多采用競(jìng)爭(zhēng)法原理設(shè)計(jì)，將預(yù)處理后含有待測(cè)組分的樣本與熒光物標(biāo)記的25-OH VD 單克隆抗體結(jié)合，形成熒光物-抗體-抗原的復(fù)合物。在層析作用下，該復(fù)合物沿著硝酸纖維膜向前層析至檢測(cè)區(qū)（T 區(qū)），與T 區(qū)包被的25-OH VD-BSA 修飾抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。游離的熒光標(biāo)記抗體層析至質(zhì)控區(qū)（C 區(qū)），與C 區(qū)包被的二抗結(jié)合結(jié)合，形成質(zhì)控區(qū)的熒光條帶。在激發(fā)光源的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，熒光免疫分析儀俘獲熒光信號(hào)。由于樣本中的25-OH VD 與T 區(qū)的修飾抗原呈競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系呈競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，因而T 區(qū)熒光強(qiáng)度與樣本中的25-OH VD 濃度成反比，熒光免疫分析儀通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)化及設(shè)定的定標(biāo)曲線自動(dòng)轉(zhuǎn)化為定量數(shù)值，計(jì)算出樣本中25-OH VD 的濃度。

沈駿［31］利用量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬，發(fā)射峰窄而對(duì)稱，抗光漂白能力強(qiáng)等特點(diǎn)，建立了量子點(diǎn)熒光微球免疫層析法檢測(cè)25-OH VD 的方法，結(jié)果表明方法精密度高、準(zhǔn)確性良好。

普通熒光免疫層析法反應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)成本較低，對(duì)檢測(cè)人員的要求不高，方便其在基層醫(yī)院廣泛推廣，但是存在靈敏度低、重復(fù)性差等問(wèn)題。基于此普菲特益斯生物科技（北京）有限公司研發(fā)了一種高靈敏檢測(cè)25-OH VD 的時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)試劑，該方法試劑盒既有普通熒光免疫層析法的優(yōu)點(diǎn)，又可以解決靈敏度低等問(wèn)題。但缺點(diǎn)依然是只能檢測(cè)總25-OH VD［32］。

2.2.5 膠乳免疫比濁法（Latex Immunoturbidimetry）

膠乳免疫比濁法主要利用抗體標(biāo)記的膠乳微球與抗原反應(yīng)形成交聯(lián)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，它會(huì)引起特定波長(zhǎng)的吸光度發(fā)生改變，吸光度的變化與血清樣本中的25-OH VD 的含量成正比。

深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的“25-羥基維生素D（25-OH VD）測(cè)定試劑盒（膠乳免疫比濁法）”利用膠乳免疫比濁法測(cè)定人血清中25-OH VD 的含量。該方法與普通臨床生化檢測(cè)的使用方法相似，但由于反應(yīng)成分較多，目前市面上多使用三試劑的形式，如邁瑞、美康等。該方法可適用于全自動(dòng)生化分析儀，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，血清樣本無(wú)需進(jìn)一步前處理步驟即可檢測(cè)，出結(jié)果時(shí)間短，一般在10 分鐘內(nèi)可測(cè)出濃度。該方法參與反應(yīng)的成分較多，且是生物活性物質(zhì)，如底物、酶、抗體等，由于涉及抗體和酶的相互作用，抗體和酶等關(guān)鍵原材料篩選對(duì)于方法的建立至關(guān)重要，另一方面，各成分之間的比例協(xié)調(diào)對(duì)方法的線性、靈敏度有很大影響。因此該方法的原材料篩選及配方開(kāi)發(fā)都有較大的難度。同時(shí)，由于相關(guān)的酶、抗體要求較高，原料本身的獲取不易，而進(jìn)入生產(chǎn)端的檢驗(yàn)難度也相應(yīng)提高，因此也加大了該方法的研發(fā)及制造成本。目前膠乳免疫比濁法相關(guān)的檢測(cè)試劑盒廠家比較少，查詢數(shù)據(jù)顯示目前有13 家企業(yè)獲得注冊(cè)證。

3 結(jié)論

綜上所述，相比于LC-MS/MS 法，免疫法檢測(cè)樣本用量少、檢測(cè)設(shè)備相對(duì)便宜、儀器操作簡(jiǎn)單，適用于在中層和基層醫(yī)院開(kāi)展。但是與LC-MS/MS 法相比，免疫法易存在以下問(wèn)題：①基質(zhì)效應(yīng)和交叉反應(yīng)，容易使檢測(cè)結(jié)果偏高；②檢測(cè)結(jié)果為總25-OH VD，易低估25-OH VD2 的水平，導(dǎo)致總25-OH VD 檢測(cè)結(jié)果偏低；③無(wú)法區(qū)分25-OH VD2 和25-OH VD3，導(dǎo)致免疫法特異性差。即便是LC-MS/MS 也面臨5-OH VD 與結(jié)合蛋白徹底分離，的問(wèn)題。眾方法中特別是ELISA 檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，人工操作繁瑣，因此不適合單樣本檢測(cè)。總之，目前無(wú)論哪種免疫法的試劑盒在檢測(cè)精確性上都無(wú)法與LC-MS/MS 25-OH VD 檢測(cè)試劑盒媲美。

盡管25-OH VD2 和25-OH VD3 的結(jié)構(gòu)差異小，但是由于二者的活性和治療效果有一定的差異，因此分別檢測(cè)25-OH VD2 和25-OH VD3 并對(duì)二者活性和功能單獨(dú)進(jìn)行評(píng)價(jià)，是正確評(píng)估維生素D 水平和維生素D 補(bǔ)充療法療效的必然選擇。所以LC-MS/MS 的普及和方法標(biāo)準(zhǔn)化將是未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)之一。

實(shí)際中開(kāi)展檢驗(yàn)項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)綜合考慮費(fèi)用、空間、耗時(shí)等問(wèn)題，每個(gè)單位都可以根據(jù)自身需求選擇不同的檢測(cè)方法，然而實(shí)現(xiàn)所有方法一致性和可比性的最佳途徑仍然是制定標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范性的參考測(cè)量程序與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。