陳慧玲 張然

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193)

心血管疾病(CVD)在非傳染性疾病中死亡率居于首位，高于腫瘤及其它疾病，且目前CVD患病率仍處于持續(xù)上升階段。因此，CVD對人類健康構(gòu)成極大地威脅。為了能更好地治療CVD，動物CVD模型便成為人類探索該領(lǐng)域的重要介質(zhì)。由于缺乏有力的基因組編輯工具，CVD模型的構(gòu)建較為困難，因而人們對CVD的研究進(jìn)展緩慢。在20世紀(jì)90年代末，ZFNs編輯技術(shù)的開發(fā)開啟了第1扇定制核酸酶靶向基因組工程的大門。隨后第2代基因編輯工具TALENs被開發(fā)利用，然而，由于ZFNs和TALENs技術(shù)操作相對復(fù)雜，會影響其使用。2013年第3代基因編輯工具CRISPR/Cas9技術(shù)問世，徹底引發(fā)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域新的革命。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)

CRISPR/ Cas9系統(tǒng)包含1個gRNA，能夠?qū)⒑怂崦窩as9定位于基因組中的特定位置。gRNA由Cas9結(jié)合所必需的短RNA序列和一段約20個核苷酸序列組成。Cas9核酸酶包含HNH核酸酶和類RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域。其首先識別PAM序列，該序列為目標(biāo)DNA的側(cè)翼序列。與PAM結(jié)合后，Cas9通過其HNH和RuvC催化結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)，然后通過非同源末端連接(NHEJ)或同源重組修復(fù)(HDR)系統(tǒng)進(jìn)行基因組修復(fù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成為許多物種(如人類和小鼠細(xì)胞，斑馬魚等)中基因敲除和位點(diǎn)特異性敲除的新工具。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在CVD動物模型的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于動物CVD模型的構(gòu)建

2.1.1 斑馬魚CVD模型的構(gòu)建

斑馬魚胚胎幾乎是透明的，允許觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)而不需要侵入性的儀器。特別是心臟和血管很容易通過顯微鏡觀察到，這使得心臟收縮、血流、血管大小和模式的連續(xù)可視化和量化成為可能[1]，而且斑馬魚與人類之間遺傳關(guān)系較強(qiáng)，且分子信號通路顯著相關(guān)，使得斑馬魚成為模擬復(fù)雜發(fā)育過程的有用工具。因此，許多科研工作者選用斑馬魚研究不同基因突變致CVD的機(jī)理。血漿低密度脂蛋白膽固醇升高是動脈粥樣硬化和心血管疾病發(fā)生的主要危險因素，而LDL受體(LDLR)缺陷是人類家族性高膽固醇血癥的主要原因。近年來，通過使用CRISPR/Cas9方法獲得ldlr突變斑馬魚模型，在正常飼喂條件下，斑馬魚發(fā)展為中度高膽固醇血癥；在采用高膽固醇飼喂5d后加重斑馬魚的高膽固醇血癥和血管脂質(zhì)沉積[2]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建GTPBP3敲除斑馬魚，結(jié)果顯示，GTPBP3基因缺失導(dǎo)致線粒體功能障礙，致使產(chǎn)生肥厚性心肌病表型，重現(xiàn)攜帶GTPBP3突變的HCM患者的臨床表型[3]。

2.1.2 小鼠CVD模型的構(gòu)建

CRISPR/Cas9系統(tǒng)已然成為制作遺傳工程小鼠當(dāng)下最流行的編輯工具，能夠直接應(yīng)用于胚胎。來自賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，血友病B家族在F9基因中攜帶一個新的突變Y371D，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生了不同的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并證實(shí)了新的Y371D突變導(dǎo)致的血友病B表型比Y371S突變更為嚴(yán)重。該研究首次開發(fā)出一種雙基因療法，其能夠?qū)RISPR/Cas9介導(dǎo)的基因靶向系統(tǒng)的關(guān)鍵組分運(yùn)輸?shù)叫∈髾C(jī)體中來治療B型血友病[4]。此外，Caroll等人已經(jīng)培育出只在心肌組織特異表達(dá)的Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過將靶向Myh6的sgRNA 裝載在AAV載體上注射入小鼠，實(shí)現(xiàn)Myh6的敲除，導(dǎo)致小鼠心臟功能受損和明顯肥大[5]。因而CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以探索心臟特異表達(dá)基因在心臟功能和發(fā)育中的特定作用，并有效糾正出生后/成年小鼠的遺傳缺陷。

2.1.3 豬CVD模型的構(gòu)建

豬和人的心血管系統(tǒng)在冠狀動脈血管的大小、分布、血壓、心率、心臟指數(shù)和最大氧氣消耗等方面表現(xiàn)出相似之處，且具有相似的藥物藥代動力學(xué)。因而豬是研究人類CVD的重要模型。Huang等人利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時靶向巴馬小型豬載脂蛋白E (ApoE)和低密度脂蛋白受體(LDLR)基因，成功獲得雙等位基因敲除豬。該基因修飾豬的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、載脂蛋白B(APOE)水平明顯升高[6]。Fang等人構(gòu)建的ApoE -/-豬在常規(guī)飼喂條件下血漿膽固醇水平適度升高，但在高脂高膽固醇(HFHC)飲食6個月后，出現(xiàn)嚴(yán)重高膽固醇血癥，并在主動脈和冠狀動脈中出現(xiàn)類似人的動脈粥樣硬化病變[7]。這些模型對CVD的研究和相關(guān)轉(zhuǎn)化研究具有一定參考價值。

2.1.4 非人靈長類CVD模型的應(yīng)用

NHPs基因組的精確修飾對生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展具有巨大推動力。然而NHPs具有性成熟時間長、繁殖率低、繁殖困難等特點(diǎn)，傳統(tǒng)育種產(chǎn)生雙等位基因突變NHPs，以進(jìn)行功能缺失的研究非常具有挑戰(zhàn)性。近年來，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因編輯使這一過程變得較為容易。目前利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過合子注射，已成功構(gòu)建p53突變體猴，該模型對壓力超載期間p53誘導(dǎo)的炎癥如何導(dǎo)致心功能障礙，以及p53誘導(dǎo)的心血管細(xì)胞衰老為何促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生的研究具有重要意義[8,9]。

2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在CVD治療中的應(yīng)用

雖然針對CVD的藥理學(xué)和侵入性治療可以達(dá)到減輕癥狀和延緩疾病進(jìn)展的目的，但目前仍然需要其它治療方法來有效治療甚至治愈CVD。AAV-CRISPR/Cas9成為研究者的首選。AAV是單鏈(ss)DNA載體，具有良好的安全性，能夠在包括心臟在內(nèi)的多種靶組織中實(shí)現(xiàn)持久地轉(zhuǎn)基因表達(dá)。目前AAV-CRISPR/Cas9已用于緩解兒茶酚胺敏感性多形性室性心動過速(CPVT)、DMD等小鼠模型和DMD豬模型的病癥。CPVT常由RYR2的功能獲得性突變所引起，為實(shí)現(xiàn)長期有效地治療CPVT，研究者給P10 Ryr2R176Q/+小鼠皮下注射AAV9-CRISPR/Cas9 5～6周，該系統(tǒng)能夠在體內(nèi)有效破壞心肌細(xì)胞中Ryr2突變等位基因，且接受AAV-CRISPR治療的R176Q/+小鼠未出現(xiàn)心律失常[10]。對3月齡mdx小鼠尾靜脈注射SERCA2a AAV9載體，阻止其擴(kuò)張型心肌病的發(fā)展[11]。AAV9-Cas9-gE51處理DMDΔ52豬模型恢復(fù)其心臟抗肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)，延長其壽命，減少心律失常的易感性[12]。這些結(jié)果證實(shí)，通過AAV-CRISPR/Cas9傳遞系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)基因編輯可能是治療CVD的一種有效治療方法，同時有可能改善藥物的療效。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)的局限性

CRISPR/Cas9工具雖能緩解心血管疾病模型癥狀，但其也是一把雙刃劍，高編輯效率成為其直接應(yīng)用于人臨床治療的一大障礙，使其在整個基因組的脫靶位點(diǎn)均可能發(fā)生突變。HDR能夠在基因組中引入特定的突變，然而HDR只在S期或G2期的增殖細(xì)胞中起作用，而NHEJ在細(xì)胞周期所有階段不同類型的細(xì)胞都能發(fā)揮作用。因此目前運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)通過HDR校正成熟的心臟和血管組織致病突變較為困難。

有望克服上述局限性的技術(shù)是體內(nèi)單堿基編輯器的使用。單堿基編輯器是被修飾過的CRISPR/Cas9工具，能夠改變單個堿基對而不發(fā)生DSB，如BE3僅能引起單鏈斷裂，并與胞嘧啶脫氨酶結(jié)構(gòu)域連接，該結(jié)構(gòu)域能夠在切口處將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。目前已有研究通過腺病毒載體分別將BE3遞送入Pcsk9突變和ANGPTL3突變小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后小鼠血漿膽固醇水平顯著下降[13,14]。然而單堿基編輯器僅限于點(diǎn)突變的產(chǎn)生，無法實(shí)現(xiàn)基因的敲除，而且較大的組分難以包裝成病毒顆粒。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因功能研究和多種動物疾病模型的構(gòu)建，并且作為一種治療手段，該技術(shù)在動物模型上的可行性和有效性也已被研究。雖然CRISPR/Cas9技術(shù)也有其不可避免的局限性，如脫靶問題較為嚴(yán)重，但是現(xiàn)如今世界科技水平日益增強(qiáng)，基因編輯技術(shù)的發(fā)展如此迅猛，相信不久的將來科研人員能夠?qū)F(xiàn)階段基因編輯工具存在的缺陷逐步解決，未來能夠直接應(yīng)用于人類CVD的治療。