劉容枝 方麗 徐超

作者單位：國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京100081

世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）2017年全球結(jié)核病報告顯示，中國結(jié)核病患者的例數(shù)位居世界第三，并且是世界三大耐多藥結(jié)核病高發(fā)國家之一。耐藥結(jié)核病指由耐藥結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病。傳統(tǒng)藥敏試驗是確診耐藥結(jié)核病的唯一方法，但其周期長，容易延誤治療。基于分子生物學(xué)方法的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測試劑（以下簡稱基因藥敏試驗）可快速檢測結(jié)核分枝桿菌基因組中與特定耐藥相關(guān)的基因突變，較快確定患者對某種特定結(jié)核藥物的耐藥性［1-3］。

筆者長期從事結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測試劑的技術(shù)審評工作。在本文中，筆者將總結(jié)分析該類試劑的臨床應(yīng)用價值和注冊情況，同時對該類試劑設(shè)計研發(fā)時應(yīng)重點關(guān)注的產(chǎn)品設(shè)計、主要原材料選擇和性能評估等技術(shù)問題進行探討，以期對生產(chǎn)企業(yè)進行相關(guān)試劑的注冊申報進行技術(shù)指導(dǎo)。

1 該類試劑的臨床使用場景

在臨床實踐中，臨床機構(gòu)使用該類試劑對來自確診結(jié)核病患者的臨床樣本培養(yǎng)物進行檢測。如從臨床樣本培養(yǎng)物中檢出結(jié)核分枝桿菌基因組中與某種結(jié)核藥物耐藥相關(guān)的基因突變，則提示提供該臨床樣本的結(jié)核病患者可能對該結(jié)核藥物耐藥，該結(jié)核病患者為對某種結(jié)核藥物耐藥的耐藥結(jié)核病患者。

與傳統(tǒng)藥敏試驗相比，基因藥敏試驗敏感性更高，操作更簡單可行，且能更快獲得結(jié)果。因此，基因藥敏試驗一經(jīng)問世，即獲得許多臨床使用單位的青睞。目前臨床可用的基因藥敏試驗試劑多為一線結(jié)核藥物耐藥檢測試劑。隨著我國耐藥結(jié)核病患者的急劇增多，二線結(jié)核藥物耐藥結(jié)核病病例也頻見報道，臨床急需二線結(jié)核藥物基因藥敏試驗檢測試劑［4-5］。

2 該類試劑的注冊情況

該類試劑采用分子生物學(xué)方法定性檢測臨床樣本培養(yǎng)物中結(jié)核分枝桿菌基因組中與特定耐藥相關(guān)的基因突變，用于耐藥結(jié)核病的輔助診斷，便于臨床醫(yī)生合理選擇結(jié)核藥物。截至目前，經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準的國產(chǎn)基因藥敏試驗試劑有9 個，進口基因藥敏試驗試劑有3 個，用于耐藥性檢測的藥物類型主要為結(jié)核患者一線藥物，包括利福平、異煙肼、鏈霉素和佛喹諾酮等。方法學(xué)主要包括線性雜交酶顯色法、熔解曲線法、基因芯片法和一代測序法等。

3 該類試劑設(shè)計研發(fā)時應(yīng)重點關(guān)注的技術(shù)問題

3.1 質(zhì)控

為避免臨床使用時假陰性和假陽性結(jié)果對患者的危害，應(yīng)對該類試劑的檢測過程進行有效質(zhì)控。因此，該類試劑應(yīng)設(shè)立內(nèi)標、陰性對照和陽性對照，以對樣本核酸分離純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染和靶核酸降解等進行合理質(zhì)控，避免出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。內(nèi)標、陰性對照和陽性對照均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取純化。

3.2 主要原材料研究

對于該類試劑而言，主要原材料主要為引物、探針、反應(yīng)液和聚合酶。該類試劑一般可同時檢測多個基因突變位點。因此，產(chǎn)品設(shè)計時需設(shè)計多對引物和探針。如多對引物和探針存在于一個反應(yīng)體系，則應(yīng)在設(shè)計開發(fā)時著重驗證不同引物探針對彼此的干擾。鑒于一般引物探針為外購，應(yīng)提交對引物探針供應(yīng)商的選擇依據(jù)及研究數(shù)據(jù)。對于自制聚合酶，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立穩(wěn)定的自制聚合酶的工藝流程及質(zhì)量標準。

3.3 企業(yè)參考品

企業(yè)參考品對該類試劑的質(zhì)量控制至關(guān)重要。企業(yè)應(yīng)建立科學(xué)合理的陽性參考品、陰性參考品、精密性參考品和最低檢出限參考品。陽性參考品、最低檢測限參考品和精密度參考品，應(yīng)包括試劑聲稱的全部基因突變類型，且各參考品的突變類型需經(jīng)過金標準方法或已上市同類分型試劑的確認。常見突變類型的上述參考品至少有1～2 種突變類型采用菌株，其他突變類型的上述參考品可以采用含有突變的核酸。陰性參考品可采用經(jīng)確認靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌菌株或試劑聲稱的其他無關(guān)突變類型的核酸等。

4 分析性能評估

分析性能評估資料是注冊申報資料的重要技術(shù)文件。該類試劑的分析性能評估資料需要著重考慮最低檢測限、分析特異性和配套核酸提取試劑的提取效率等。

擴增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的核酸量越多，則越容易檢出。而終體系中的這兩個因素是由臨床樣本中的結(jié)核分枝桿菌耐藥菌與野生菌的含量和相對比例決定的。因此，在進行最低檢出限研究時，應(yīng)考慮100%耐藥比例下，耐藥菌株/突變核酸的最低檢測濃度；同時，應(yīng)考慮不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限。

還應(yīng)特別考慮申報產(chǎn)品的分析特異性，關(guān)注野生型序列是否會檢出突變陽性，以及申報產(chǎn)品聲稱的全部突變類型間是否存在交叉。另外，還需對核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體進行交叉反應(yīng)的驗證。

另外，還需特別注意干擾物質(zhì)對申報產(chǎn)品檢測性能的影響。應(yīng)考慮內(nèi)源性干擾和外源性干擾。內(nèi)源性干擾主要考慮臨床樣本中可能含有的物質(zhì)對申報產(chǎn)品檢測性能的影響，一般采用不含待檢野生/突變靶標的相應(yīng)臨床樣本進行試驗。而外源性干擾則主要考慮外源性藥物帶來的干擾，包括異煙肼、利福平、抗生素和鼻腔噴霧劑或滴鼻劑等常見藥物的干擾等。

鑒于核酸提取效率對申報產(chǎn)品的后續(xù)檢測具有重要影響，生產(chǎn)企業(yè)還需考慮不同樣本前處理方法和核酸提取純化方法對申報產(chǎn)品檢測性能的影響。如某種樣本類型可采用幾種方法進行樣本前處理或采用幾種方法進行核酸提取純化，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)提交適用的樣本前處理方法或核酸提取純化方法與后續(xù)試驗配合進行的性能試驗，以證明不同的樣本前處理方法或核酸提取純化方法不影響檢測結(jié)果。

5 結(jié)論與展望

本文總結(jié)了結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測試劑的臨床應(yīng)用價值和注冊情況，并對該類試劑設(shè)計研發(fā)時應(yīng)重點關(guān)注的產(chǎn)品設(shè)計、主要原材料選擇和性能評估等技術(shù)問題進行探討，以期對生產(chǎn)企業(yè)進行相關(guān)試劑的注冊申報進行技術(shù)指導(dǎo)。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注方法學(xué)本身的特點，不斷優(yōu)化原材料與體系設(shè)置，不斷提高產(chǎn)品性能，確保產(chǎn)品滿足臨床使用需求。