李軼春

病毒性肝炎是指由病毒引起的肝臟炎癥，根據(jù)病原學(xué)分類(lèi)將其分為甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E Virus，HEV）。病毒性肝炎大流行對(duì)生命、社區(qū)和衛(wèi)生系統(tǒng)將會(huì)造成重大損失。據(jù)估計(jì)，全球每年有140 萬(wàn)人死于急性感染以及與肝炎相關(guān)的肝癌和肝硬化，其中，大約47%是由HBV引起的，48%是由HCV 引起的，其余是由HAV 和HEV 引起的［1］。HBV 感染是導(dǎo)致中國(guó)人群發(fā)生肝癌的主要危險(xiǎn)因素，目前，仍有930 萬(wàn)慢性HBV 感染者［2］，與HBV 相關(guān)的肝癌患者約占所有肝癌患者的80%［3-4］。預(yù)計(jì)到2030年全球?qū)⒙愿窝赘腥韭蕪哪壳暗?00～1 000 萬(wàn)例降低到90 萬(wàn)例，將慢性肝炎年死亡率從140 萬(wàn)例降低到50 萬(wàn)例以下［5］。此外，病毒性肝炎也是導(dǎo)致艾滋病毒感染者死亡的一個(gè)日益嚴(yán)重的原因，同時(shí)感染艾滋病毒及HCV 人數(shù)約達(dá)290 萬(wàn)，260 萬(wàn)人感染了HBV［6］。病毒性肝炎是一項(xiàng)國(guó)際公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，因此，提高病毒性肝炎的診斷率，找到靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)降低病毒性肝炎的發(fā)病率、癌變率、致殘致死率至關(guān)重要。在這篇綜述中，筆者將總結(jié)目前關(guān)于病毒性肝炎的血清標(biāo)志物及檢測(cè)方法，旨在為臨床篩查提供思路，以期早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防，早診斷、早治療。

1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA 是在免疫酶技術(shù)（immunoenzymatic techniques）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)，具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。ELISA 過(guò)程包括抗原吸附在固相載體上（即包被），加待測(cè)抗體，加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體，生成抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。檢測(cè)者采用分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體的量，并將待測(cè)抗體的定量與有色產(chǎn)生成正比。

2 時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（Time-Resoled Fluoroimmunoassay，TRFIA）

TRFIA 是運(yùn)用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物代替熒光物質(zhì)、同位素或酶標(biāo)記蛋白質(zhì)、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生后用TRF 儀器測(cè)定最后產(chǎn)物中熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度或相對(duì)熒光強(qiáng)度比值來(lái)判斷反應(yīng)體系被分析物的濃度達(dá)到定量分析之目的。通過(guò)利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時(shí)間段檢測(cè)特異性熒光，而在此時(shí)間之前，非特異性熒光已完全衰減為0，從而提高了檢測(cè)的靈敏度，縮短了急性乙肝檢測(cè)的“窗口期”。TRFIA 具有零本底、靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、試劑有效期長(zhǎng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)穩(wěn)定性好、易于自動(dòng)化等特點(diǎn)。

3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Electro-Chemiluminescence Immunoassay，ECLIA）

ECLIA 主要在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，是采用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記Ab 通過(guò)Ag-Ab 反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的Ag或Ab 進(jìn)行定量/定性，是繼TRFIA 之后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，是電化學(xué)發(fā)光和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物，具有敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、測(cè)定范圍寬、試劑穩(wěn)定、無(wú)毒害無(wú)污染、有效期長(zhǎng)、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、易于自動(dòng)化等特點(diǎn)。

4 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法（Chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）

CMIA 分為小分子抗原物質(zhì)的測(cè)定采用競(jìng)爭(zhēng)法和大分子的抗原物質(zhì)測(cè)定采用雙抗體夾心法，主要包括兩種反應(yīng)過(guò)程：（1）競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：用過(guò)量包被磁顆粒的抗體，與待測(cè)的抗原和定量的標(biāo)記吖啶酯抗原同時(shí)加入反應(yīng)杯溫育，其免疫反應(yīng)的結(jié)合形式有兩種，一是標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物；二是測(cè)定抗原與抗體的結(jié)合形式；（2）雙抗體夾心法：標(biāo)記抗體與被測(cè)抗原同時(shí)與包被抗體結(jié)合成一種反應(yīng)形式，即包被抗體-測(cè)定抗原-發(fā)光抗體的復(fù)合物。

5 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)QPCR）

FQPCR 包括探針類(lèi)和染料類(lèi)兩種，探針類(lèi)是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指導(dǎo)擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，其具有特異性好、靈敏度高、線(xiàn)性關(guān)系好、線(xiàn)性范圍寬、操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染、速度快、高通量等特點(diǎn)。染料類(lèi)主要原理為當(dāng)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，外來(lái)的光源激發(fā)供體熒光染料發(fā)出熒光，當(dāng)其發(fā)射波長(zhǎng)與受體熒光染料的吸收波長(zhǎng)部分重疊，且兩者的距離很近時(shí)，受體熒光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發(fā)出另一波長(zhǎng)的熒光，同時(shí)將供體熒光淬滅。

6 免疫學(xué)方法檢測(cè)技術(shù)在臨床中的應(yīng)用

黃旭華等人［7］分別以ELISA、膠體金法行免疫學(xué)檢驗(yàn)HAV，分析檢驗(yàn)結(jié)果，研究結(jié)果顯示，采用ELISA 檢測(cè)HAV 的診斷準(zhǔn)確率較高。鄒錦群等人［8］在2017年豐城市300 人5 種傳染病抗體水平監(jiān)測(cè)分析研究中采用ELISA 檢測(cè)HAV 抗體，結(jié)果顯示HAV Ab 被檢出的陽(yáng)性率較高，側(cè)面印證了ELISA 用于檢測(cè)HAV 的臨床可行性。黃嫵姣等人［9］分別用ECLIA 和ELISA 檢測(cè)HAV 抗體IGM，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，比較并分析了陽(yáng)性符合率，研究結(jié)果顯示，ECLIA 檢測(cè)HAV-IgM 的敏感度為62.5%、特異性為100.0%、陽(yáng)性檢出率為4.3%，ELISA 檢測(cè)的敏感度為100.0%、特異性為71.3%、陽(yáng)性檢出率為33.6%，通過(guò)結(jié)果可以看出，ECLIA 和ELISA 兩種檢測(cè)方法對(duì)于檢測(cè)HAV 的一致性很低，但二者各有優(yōu)勢(shì)，ELISA 檢測(cè)HAV 的敏感度高，ECLIA 檢測(cè)HAV 的特異性強(qiáng)。此外，王峰蕾等人［10］參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的EP15-A2 文件和中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)的CNALCL39 相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定HAV-IgM 的精密度、檢出限、正確度以及試劑盒的臨界值進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，陽(yáng)性結(jié)果符合率為100%，提示全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀檢測(cè)方法更標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范，結(jié)果更客觀。以上學(xué)者的研究均證實(shí)了ELISA 檢測(cè)法在HAV 篩查中的廣泛應(yīng)用及特異性、敏感性。

焦陽(yáng)等人［11］探討分別采用ECLIA 和ELISA 兩種不同免疫檢驗(yàn)方法檢測(cè)HBV 感染血清學(xué)標(biāo)志物的臨床對(duì)比情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECLIA 檢測(cè)HBV較ELISA 檢測(cè)的準(zhǔn)確率高，但在陽(yáng)性檢出率的對(duì)比上差別不大。趙超芬［12］對(duì)比用ECLIA、ELISA及TRFIA 檢測(cè)HBV 標(biāo)志物在診斷HBV 中的應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用CLIA 法檢測(cè)HBsAg、HBsAb、HBeAg 的陽(yáng)性檢出率均為最高，使用ELISA法檢測(cè)HBeAb 的陽(yáng)性檢出率最高，使用TRFIA 法檢測(cè)HBcAb 的陽(yáng)性檢出率最高，使用TRFIA 法診斷HBV 的靈敏度和特異度均高于用ELISA 法，可以推測(cè)三種檢測(cè)方法各有優(yōu)勢(shì)，臨床中可根據(jù)患者的個(gè)體差異，選擇不同的檢測(cè)方法。王紅翠等人［13］探討了化學(xué)發(fā)光法及ELISA 法兩種不同檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于乙型肝炎病毒核心抗體陽(yáng)性率篩查中的臨床價(jià)值及檢測(cè)意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的陽(yáng)性率更高，結(jié)果更準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)更客觀真實(shí)，具有預(yù)測(cè)作用。上述結(jié)果表明ECLIA 和ELISA、CLIA 等檢測(cè)方法在臨床篩查HBV 各有優(yōu)勢(shì)，應(yīng)根據(jù)臨床實(shí)際選擇單獨(dú)檢測(cè)或聯(lián)合檢測(cè)。

薛海玲等人［14］比較CMIA 法、ELISA 法在HCV 檢測(cè)中的應(yīng)用效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CMIA 法檢測(cè)HCV-Ab 陽(yáng)性率為100%，ELISA 法檢測(cè)HCV-Ab陽(yáng)性率為76.32%，CMIA 法檢測(cè)HCV-Ab 的靈敏度高于ELISA 法，CMIA 法與ELISA 法檢測(cè)HCV-Ab陽(yáng)性一致率為72.32%，總一致率為92.21%，得出結(jié)論為CMIA 法測(cè)定HCV-Ab 的精密度、靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均較高。吳小文［15］搜集120 例HCV 患者血清標(biāo)本，分別采用ELISA、ECLIA、熒光定量PCR 法進(jìn)行檢測(cè)，觀察并分析三種檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果顯示，采用ELISA 檢測(cè)HCV 的陽(yáng)性率為73.33%，采用ECLIA 檢測(cè)HCV的陽(yáng)性率為75.00%，采用熒光定量PCR 法檢測(cè)HCV 的陽(yáng)性率為90.83%，檢測(cè)準(zhǔn)確率均較高，但僅有采用熒光定量PCR 法檢測(cè)HCV 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述研究結(jié)果可以推測(cè)采用熒光定量PCR法檢測(cè)HCV 結(jié)果最佳。

近年來(lái)，病毒性肝炎血清標(biāo)志物檢測(cè)方法不斷發(fā)展、更新。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Neural growth factor，NGF）含有兩種非共價(jià)結(jié)合單體，每個(gè)單體都有四個(gè)帶有極性氨基酸序列的環(huán)區(qū)和兩條β鏈。在肝臟微環(huán)境中，NGF 在受損肝細(xì)胞中表達(dá)，參與對(duì)肝損傷的控制過(guò)程，主要是通過(guò)p75NTR 對(duì)纖維化細(xì)胞發(fā)揮凋亡作用，并上調(diào)膽汁淤積性肝組織中的肝保護(hù)成分。Pereira［16］的研究發(fā)現(xiàn)具有與正調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)保守和因子生理學(xué)相關(guān)的多態(tài)性變異的患者表現(xiàn)出與病毒載量和肝酶相反的行為，表明NGF 和p75NTR 在炎癥和纖維化的不同階段相互作用。Sun［17］的研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)蛋白有助于診斷與鑒別HBV 及肝衰竭，評(píng)估肝功能異常和預(yù)測(cè)肝病結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HNF-1α 和HNF-4α 兩種肝核因子與肝功能相關(guān)，富含組氨酸的糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）可反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，為臨床制定診斷方案及治療策略提供數(shù)據(jù)?；诔暤膹椥猿上窈脱逯笜?biāo)已被單獨(dú)驗(yàn)證為慢性病毒性肝炎肝纖維化分期的無(wú)創(chuàng)方法，Udompap［18］以HBV 或HCV 單感染患者為研究對(duì)象，旨在比較病毒性肝炎患者瞬時(shí)彈性成像（transient elastography，TE）、剪切波彈性成像（shear wave elastography，SWE）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶血小板指數(shù)和纖維化-4 指數(shù)（Fibrosis-4，F(xiàn)IB4）與肝纖維化分期的準(zhǔn)確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用M 或XL 探針的超聲心動(dòng)圖是一種極好的彈性成像技術(shù)，可無(wú)創(chuàng)地預(yù)測(cè)HBV 或HCV 患者的肝纖維化程度，特別是晚期纖維化和肝硬化患者。SWE 點(diǎn)可以作為排除晚期纖維化和肝硬化的輔助超聲工具。雖然FIB4的診斷準(zhǔn)確性低于某些彈性成像技術(shù)，但在醫(yī)療技術(shù)有限的情況下，F(xiàn)IB4 在臨床上可用于排除肝硬化。Khodjaeva［19］對(duì)6589 例病毒性肝硬化患者進(jìn)行HBV 單次感染、HCV 感染和高密度脂蛋白重疊感染乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性肝硬化的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)超過(guò)80%的HBV 表面抗原陽(yáng)性肝硬化患者存在高密度脂蛋白雙重感染，高密度脂蛋白似乎是晚期病毒性肝病和青少年肝硬化的主要原因。循環(huán)自耗蛋白（Autotaxin，ATX）在肝病患者中升高，特別是在HCV 病毒和丙型肝炎病毒/艾滋病感染的環(huán)境中，血漿ATX 水平部分歸因于纖維化肝病繼發(fā)的肝臟清除受損。Kostadinova［20］發(fā)現(xiàn)血漿ATX 與HCV 和丙型肝炎病毒/艾滋病感染期間的系統(tǒng)免疫激活參數(shù)有關(guān)，在開(kāi)始無(wú)干擾素直接作用抗病毒丙型肝炎病毒治療的幾個(gè)月內(nèi)，ATX 水平部分正?；?，這與非纖維化肝病導(dǎo)致ATX 水平升高或丙型肝炎病毒介導(dǎo)的肝細(xì)胞活化一致。ATX、溶血磷脂酸和全身免疫激活參數(shù)之間的關(guān)系與丙型肝炎病毒感染、肝細(xì)胞癌等相關(guān)，認(rèn)為ATX 水平通常與ATX 酶活性產(chǎn)物溶血磷脂酸的水平相關(guān)，是一種通過(guò)溶血磷脂酸受體傳遞信號(hào)的脂質(zhì)介質(zhì)；ATX-LPA 軸與丙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒/艾滋病感染環(huán)境中的系統(tǒng)性免疫激活相關(guān)；在慢性肝病毒感染期間，非纖維化和可逆成分導(dǎo)致ATX 水平升高。Joanna［21］對(duì)138 例慢性丙型病毒性肝炎患者進(jìn)行了戊聚糖3（Pentosan 3，PTX3）與炎癥活性和纖維化的生化和組織學(xué)參數(shù)的相關(guān)性研究，目的是探究PTX3 檢測(cè)HCV 患者的臨床顯著纖維化的準(zhǔn)確性，證實(shí)了PTX3 作為顯著纖維化的單一標(biāo)志。

7 小結(jié)與展望

不同的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)適用于不同的病毒性肝炎分型，為了實(shí)現(xiàn)2030年徹底將病毒性肝炎這一疾病徹底根除的終極目標(biāo)，臨床醫(yī)師、科研專(zhuān)家還需更加努力，不斷提高檢測(cè)技術(shù)水平，不斷更新檢測(cè)設(shè)備及試劑盒，規(guī)范檢測(cè)流程。