程秀蓮 韓利峰 唐秀麗 趙娜 劉寧寧

索拉非尼作為晚期肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的獨(dú)特靶向藥物,可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成[1-2]。JAK蛋白與多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)細(xì)胞的存活和增殖有關(guān)[3]，Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白(kinase/Signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT)信號通路是生長因子和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)過程中必不可少的部分，已經(jīng)成為許多免疫、炎癥、腫瘤和造血疾病的具有吸引力的靶標(biāo)[4]，因此，JAK / STAT信號通路抑制劑可能為肝癌的治療提供新策略。本研究旨在探討索拉非尼對肝癌細(xì)胞株HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1細(xì)胞活性的抑制作用和細(xì)胞凋亡的影響，以及對JAK / STAT信號通路蛋白表達(dá)水平的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

肝癌細(xì)胞株HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，并于本實(shí)驗(yàn)室保存使用；索拉非尼由德國拜耳醫(yī)藥保健股份公司生產(chǎn)；胎牛血清( fetal bovine serum，F(xiàn)BS) 、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(gbico)購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；MTT購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；DMSO由杭州碧云天生物科技有限公司生產(chǎn)；鼠抗人JAK2、STAT3、β-actin抗體購自Cell Signaling Technology公司；二氧化碳培養(yǎng)箱和流式細(xì)胞儀均購于美國Thermo Scientific公司。

二、 實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)

從超低溫冰箱中取出各凍存細(xì)胞，解凍、洗滌、消化處理后，分別接種于含10% FBS的DEME培養(yǎng)液中(不含抗菌藥物)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

(二)MTT法檢測索拉非尼對肝癌細(xì)胞的抑制作用

(1)不同濃度索拉非尼對肝癌細(xì)胞的抑制作用。分別將肝癌細(xì)胞HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成細(xì)胞密度為3×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，每孔中接入100 μL細(xì)胞懸液，然后加入不同濃度的索拉非尼10 μL，實(shí)驗(yàn)組為不同濃度的索拉非尼組，其濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、10.0和20.0 μmol/L，另外設(shè)加入等體積DMSO(索拉非尼溶劑)的孔為空白對照，不同細(xì)胞株和不同濃度分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加入索拉非尼后細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h 每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測量各孔光密度值。細(xì)胞抑制率計(jì)算式：細(xì)胞抑制率=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值×100%

(2)作用時(shí)間對細(xì)胞抑制作用的影響。分別將肝癌細(xì)胞HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1調(diào)節(jié)成細(xì)胞密度為3×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，每孔中接入100 μL細(xì)胞懸液，然后每孔分別加入10.0 μmol/L索拉非尼10 μL，另外設(shè)加入等體積DMSO的孔為空白對照，不同細(xì)胞株和不同作用時(shí)間分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每種細(xì)胞株分別于培養(yǎng)24、48和72 h后加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測量各孔光密度值。細(xì)胞抑制率以(1)式計(jì)算。

(三)流式細(xì)胞儀檢測索拉非尼對肝癌細(xì)胞HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1凋亡的影響。胰酶消化培養(yǎng)皿中各肝癌細(xì)胞株，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后，收集細(xì)胞調(diào)整密度至3×106個(gè)/mL細(xì)胞，以加入100 μL DMSO的細(xì)胞樣品為對照組，以加入100 μL 10.0 μmol/L索拉非尼的細(xì)胞樣品為試驗(yàn)孔，二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30 min后，各細(xì)胞樣品置于流式細(xì)胞儀中檢測索拉非尼對細(xì)胞凋亡的影響。

(四)qRT-PCR檢測索拉非尼處理對各肝癌細(xì)胞株中JAK2和STAT3 mRNA的影響。用10.0 μmol/L索拉非尼孵育各細(xì)胞株48 h后收集細(xì)胞，依據(jù)異丙醇沉淀法步驟提取細(xì)胞中RNA，按照2×SYBR real-time RT-PCR premixture試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)先用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性50 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)和合成。通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]收集PCR數(shù)據(jù)，采用相對定量的方法分析細(xì)胞株中JAK2和STAT3 mRNA的含量。

(五)Western bloting 檢測各細(xì)胞株中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)的變化 收集用索拉非尼處理48 h的HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1細(xì)胞株，經(jīng)細(xì)胞裂解、離心后收集上清提取獲得細(xì)胞株中的總蛋白，用增強(qiáng)型BCA 蛋白測定試劑盒在酶標(biāo)儀中進(jìn)行蛋白含量測定。上樣緩沖液加入30 μg各細(xì)胞總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS/PAGE)電泳、蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，分別先過夜孵育JAK2、STAT3和β-actin一抗，然后再孵育4 h辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，將PVDF膜放于暗室中滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，在暗室中曝光、定影、顯影，利用化學(xué)發(fā)光儀對Western bloting產(chǎn)生的條帶進(jìn)行定量分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、索拉非尼對肝癌細(xì)胞的抑制作用

不同濃度的索拉非尼對HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1肝癌細(xì)胞進(jìn)行處理，48 h后利用MMT法檢測細(xì)胞活性，其HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1的半數(shù)有效濃度(IC50)分別為(13.17 ± 0.09)μmol/L、(9.28 ± 0.05)μmol/L、(11.97 ± 0.07)μmol/L、(8.49 ± 0.06)μmol/L和(10.54 ± 0.03)μmol/L，結(jié)果顯示索拉非尼對試驗(yàn)5種肝癌細(xì)胞的活性均有抑制作用，而且隨著索拉非尼濃度的升高其細(xì)胞抑制作用越大；在相同濃度和相同培養(yǎng)條件下，隨著孵育時(shí)間的延長，索拉非尼的抑制作用也逐漸增加。此外，當(dāng)索拉非尼濃度為20 μmol/L，孵育細(xì)胞時(shí)間為72 h時(shí)，其抑制效果最佳。

二、索拉非尼對各細(xì)胞株凋亡情況的影響

經(jīng)DMSO和索拉非尼孵育后的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀下檢測，對照組細(xì)胞未出現(xiàn)大量凋亡，經(jīng)索拉非尼處理30 min后的各試驗(yàn)細(xì)胞株均出現(xiàn)大量凋亡。從流式細(xì)胞儀結(jié)果可知，索拉非尼對各細(xì)胞株細(xì)胞凋亡影響的大小順序?yàn)椋築el-7404 > MHCC97-H > SKHep-1 > QGY- 7701 > HepG2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。

三、索拉非尼對各肝癌細(xì)胞株中JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)量的影響

用1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 和20.0 μmol/L濃度的索拉非尼分別處理HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1肝癌細(xì)胞株，結(jié)果顯示，隨著索拉非尼濃度的增加，JAK2和STAT3基因表達(dá)量逐漸降低，且降低程度也不盡相同，見表1。

四、Western bloting 檢測各細(xì)胞株中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)的變化

經(jīng)10 μmol/L索拉非尼處理的各肝癌細(xì)胞株(HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1)用Western bloting檢測JAK / STAT信號通路中蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，不同人肝癌細(xì)胞株中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平與對照組相比均下降(P< 0.01)，且降低程度也不完全相同，見圖1、表2。

表1 索拉非尼對各肝癌細(xì)胞株中JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)量的影響(±s)

圖1 不同肝癌細(xì)胞株中JAK2和STAT3蛋白的表達(dá)

表2 不同肝癌細(xì)胞株經(jīng)索拉非尼作用后JAK2和STAT3蛋白相對表達(dá)量(±s)

討 論

索拉非尼可有效治療肝癌晚期患者，目前雖然索拉非尼與癌癥相關(guān)蛋白激酶靶標(biāo)建立聯(lián)系的作用機(jī)制已被充分表征，但其在人類腫瘤中誘導(dǎo)了不同的反應(yīng)，并且這種變異的原因尚不清楚[5-6]，而且索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡信號通路比較復(fù)雜。JAK/STAT信號通路參與腫瘤發(fā)生，之前研究表明，抑制JAK2/STAT3信號通路主要是通過抑制肝細(xì)胞癌的血管生成和轉(zhuǎn)移來發(fā)揮抗腫瘤作用的[7]。Thomas SJ等[8]研究結(jié)果表明JAK/STAT信號通路在癌細(xì)胞激活過程中發(fā)揮重要的作用，JAK/STAT信號通路是一種重要的通路，被認(rèn)為是治療多種癌癥的重要治療靶點(diǎn)[9]。本研究分析了索拉非尼對HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1等5種肝癌細(xì)胞株的抑制作用，結(jié)果表明索拉非尼能夠抑制這5種細(xì)胞的活性，且能促進(jìn)其細(xì)胞凋亡作用。由于 JAK/STAT信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，本研究又探索了索拉非尼對JAK/STAT信號通路蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，索拉非尼對JAK/STAT信號通路蛋白的表達(dá)具有抑制作用，說明索拉非尼發(fā)揮抗腫瘤作用可能是通過JAK/STAT信號通路起作用的。

綜上所述，索拉非尼對多種肝癌細(xì)胞均有效，其可能是通過下調(diào)JAK/STAT信號通路蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用，本研究可為索拉非尼發(fā)揮抗腫瘤作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。