邱葉貝，蔡 霈，許 暢，曹建國，崔迎紅

（1.湖南省小分子靶向藥物研制與創(chuàng)制重點實驗室，湖南師范大學醫(yī)學院，長沙 410006；2.湖南省婦幼保健院，長沙 410028）

新近研究表明肝癌干細胞是HCC 發(fā)生發(fā)展的根本原因［1，2］。我們前期研究證明HDAC 抑制劑曲古霉素 A（trichostatin A，TSA）抑制MHCC97H 源性肝癌干樣細胞（liver cancer stem-like cells，LCSLCs）自我更新能力［3］。提示HDAC 可能參與調(diào)節(jié)LCSLCs 的生物學功能。研究報道木犀草素（Luteolin，LUT）可誘導HCC 細胞凋亡，抑制細胞增殖［4］。然而，LUT 對MHCC97H 細胞系源性LCSLCs自我更新是否有抑制作用及其作用機制尚不清楚。據(jù)此，本文旨在闡明LUT 是否通過抑制HADC1 活性和表達從而抑制MHCC97H 源性LCSLCs 自我更新能力。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)人肝細胞癌 MHCC97H 細胞系購自中國科學院細胞庫（中國上海）；用含10%胎牛血清（FBS）、100 IU/ mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素的高糖DMEM 置37°C、含5%CO2的增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 MHCC97H 細胞系球細胞培養(yǎng)與擴增MHCC97H 細胞以2×103個細胞/孔的密度懸浮在由無血清DMEM / F12（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和100 IU / mL 青霉素、100μg/ mL 鏈霉素、20ng/ mL hrEGF（Invitrogen）、20ng/ mL hbFGF（Invitrogen）、2%B27（Invitrogen）、0.4%BSA（Invitrogen）和4μg/ mL 胰島素（Sigma-Aldrich）組成的腫瘤干細胞培養(yǎng)基（CSC-M）中，培養(yǎng)6 d，獲得第一代球細胞，再次球形成培養(yǎng)，得到第二代球形成細胞用作LCSLCs。

1.3 HADC 活性測定根據(jù)制造商說明書提供的實驗方案，用比色測定試劑盒（美國Bio Vision 公司）分析MHCC97H 源性LCSLCs 的HDAC1 活性。簡言之，使用Nuclear Extract 試劑盒（比利時Active Motif 公司）提取細胞核裂解物，與HDAC1 的底物一起溫育6 h，用多功能酶聯(lián)免疫儀（美國Promega 公司）取405 nm 波長讀取吸光度值。

1.4 實時熒光定量 PCR用TRIzol 試劑（美國Life Technologies 公司）提取總RNA。用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis 試劑盒（美國Life Technologies 公司）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR PremixEx Taq II方法（美國Life Technologies 公司）以ABI 7500 實時PCR系統(tǒng)（美國Thermo Fisher 公司）進行qRT-PCR 分析。2-ΔΔCt方法計算表達水平。在本研究中，使用上海生工公司（中國上海市）合成的引物：HDAC1 正向：5′-GC CATCCTGGAACTGCTAAA-3′，反向：5′-GGCTTGA AAATGGCCTCATA-3′。

1.5 Western blot按照先前發(fā)表的文獻［5］所述，在冰上，用RIPA 裂解緩沖液（美國Beyotime Biotechnology 公司）裂解收集的細胞。每個樣品的等量蛋白質(zhì)（50μg）用10%SDS-PAGE 分離。以半干印跡儀（Bio-Rad）用轉(zhuǎn)移緩沖液把分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Merck，Germany）。用含5%BSA 的TBST 室溫下封閉膜1h，在4℃下，用抗HADC1 多克隆抗體（ABclonal，Cat No. A0238）輕輕搖動過夜。作為一抗，辣根過氧化酶標記山羊抗兔Ig G 二抗室溫下孵育1h。用增強化學發(fā)光（ECL）試劑檢測目的蛋白的條帶，并通過化學發(fā)光系統(tǒng)（英國Syngene 公司）獲得印跡條帶圖譜。通過Image J 軟件測量每個條帶的灰度值。β-actin 作為加樣對照。

1.6 球形成率測定用或不用10μM LUT（Sigma Chemical）或10μM TSA（Selleck）或兩者合用處理第1 代球細胞6 d，然后，在再次球形成培養(yǎng)中，用不含藥物的CSC-M 以2000 個細胞/孔的密度接種于24 孔超低粘附培養(yǎng)板（美國Corning Inc 公司）培養(yǎng)6 d。球形成率（%）=（每孔形成的腫瘤球均數(shù)/每孔接種的活細胞數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析使用SPSS 20.0 for windows evaluation軟件（SPSS Inc，Chicago，IL）進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，單因素方差分析（One Way ANOVA）檢驗組間均數(shù)的統(tǒng)計學意義。首先方差齊性檢驗，當方差齊性時，各組均數(shù)間的兩兩比較用 LSD 法，如果方差不齊，各組均數(shù)間的兩兩比較用Dunnett 法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LUT 抑制MHCC97H 源性LCSLCs HADC1 活性和表達為了確定LUT 是否抑制MHCC97 H 細胞源性LCSLCs HADC1 活性和表達，我們評估10μM LUT處理的MHCC97 H 細胞源性LCSLCs HADC1 活性和HADC1 mRNA 表達水平以及HADC1 蛋白表達量。結(jié)果表明LUT 抑制MHCC97H 源性LCSLCs HADC1 活性（圖1A，P＜0.05），降低HADC1 mRNA 表達水平（圖1B，P＜0.05），并下調(diào)HADC1 蛋白表達（圖1C，P＜0.05）。

圖1 LUT抑制MHCC97H源性LCSLCs HADC1活性和表達

2.2 LUT 抑制MHCC97H 源性LCSLCs 球形成能力為了確定LUT 是否抑制MHCC97 H 細胞源性LCSLCs 自我更新能力，我們采用10μM LUT 處理MHCC97 H 細胞源性LCSLCs。圖2 結(jié)果表明LUT 處理顯著減少MHCC97H 源性LCSLCs 的腫瘤球數(shù)目（P＜0.05）。

2.3 LUT 聯(lián)合TSA 對MHCC97H 源性LCSLCs HADC1 活性和表達的影響我們接下來評估LUT、TSA 以及兩者合用對HADC1 活性和HADC1 mRNA 表達水平以及HADC1 蛋白表達量的影響。結(jié)果表明，與LUT 或TSA 單獨處理相比，兩者合用協(xié)作性抑制HADC1 活性（圖3A，P＜0.05），降低HADC1 mRNA 表達水平（圖3B，P＜0.05）以及下調(diào)HADC1 蛋白表達量（圖3C，P＜0.05）。

圖2 LUT抑制MHCC97H源性LCSLCs球形成能力

圖3 LUT聯(lián)合TSA對MHCC97H源性LCSLCs HADC1活性和表達的影響

2.4 LUT 聯(lián)合TSA 對MHCC97H 源性LCSLCs 球形成的影響我們最后評估LUT、TSA 以及兩者合用對MHCC97 H 細胞源性LCSLC 的球形成的影響。球形成率測定結(jié)果表明，與LUT 或TSA 單獨處理相比，兩者合用協(xié)作性減少MHCC97H 源性LCSLCs 的腫瘤球數(shù)目（圖 4，P＜0.05）。

3 討論

圖4 LUT聯(lián)合TSA對MHCC97H源性LCSLCs球形成的影響

本研究實驗結(jié)果表明：LUT 能減弱MHCC97H 源性LCSLCs 的HADC1 活性，降低HADC1 mRNA 表達水平，下調(diào)HADC1 蛋白表達，并平行地減少腫瘤球數(shù)目。提示：LUT 能通過抑制HADC1 抑制LCSLCs 自我更新。相比于單用LUT 或TSA 處理，LUT 與TSA 聯(lián)合應用協(xié)作性減弱 MHCC97H 源性LCSLCs HADC1 活性，降低HADC1 mRNA 表達水平，下調(diào)HADC1 蛋白表達，并平行地減少腫瘤球數(shù)目。提示：LUT 能夠增強TSA 抑制MHCC97H 源性LCSLCs HADC1 活性和表達及其自我更新的作用。

許多研究證明，肝癌干細胞是肝癌患者預后不良的主要原因，因為它具有很高的腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛能［6］。因此尋求能夠靶向LCSLCs 的新藥物是治療HCC 的一種有前景的策略。HDAC1 和HDAC2在大多數(shù)肝癌組織中上調(diào)［7，HDAC 抑制劑誘導癌細胞周期停滯，分化和細胞死亡，減少血管生成并調(diào)節(jié)免疫反應，它被認為是有前途的抗癌藥物，尤其是與其他抗癌藥物和/或放療聯(lián)合使用時［8］。我們團隊先前的研究表明，人HCC MHCC97H 源性第二代球細胞比親本細胞自我更新能力更強、HADC1 活性和表達更高，TSA能抑制人肝細胞癌MHCC97H 源性LCSLCs HADC1 表達以及自我更新作用［6］。本文首次證明LUT 單獨應用或聯(lián)合TSA 能通過下調(diào)HDAC1 的活性和表達抑制MHCC97H 源性LCSLCs 自我更新能力，且證實LUT 與TSA 聯(lián)合應用具有協(xié)作效應，相比與單獨應用LUT 或TSA 作用更強，為發(fā)現(xiàn)靶向LCSLCs 治療HCC 更高效，更低毒副作用的治療方案提供了實驗證據(jù)。

總而言之，本文的研究提供了HADC1 介導LUT 抑制LCSLC 自我更新能力的新見解，為臨床應用 LUT 治療HCC 提供了實驗依據(jù)，揭示了LUT 抗HCC 作用的一種新機制，同時，也為HADC1 抑制劑聯(lián)合用藥治療HCC 提供了一個新策略。這些結(jié)果表明，LUT 是治療人HCC 患者有希望的候選藥物。