劉靜，黃慧福，劉繼華 ，葉朋飛

（1.曲靖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南曲靖655011；2.曲靖師范學(xué)院，云南曲靖655011）

核桃，又名胡桃、羌桃，隸屬于胡桃科，與腰果、扁桃、榛子齊名，并稱為世界“四大干果”，主要分布在我國(guó)云南、陜西、新疆等地，是一種具有很高經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益的珍貴果木[1-4]。云南自然條件優(yōu)越，為核桃生長(zhǎng)提供了優(yōu)厚的地理?xiàng)l件，其中90%以上的縣種植核桃，種植面積、產(chǎn)量均居中國(guó)首位。

核桃分心木，簡(jiǎn)稱分心木，別名隔心木，為胡桃科植物胡桃果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜[5-7]。木質(zhì)隔膜呈薄片狀、多彎曲、破碎而不整齊，表面呈淡棕色至棕褐色，或棕黑色，略有光澤，質(zhì)脆、易折斷、氣微、味微苦，以塊大、質(zhì)薄、色黃為佳。分心木為核桃主要副產(chǎn)物之一，約占核桃總質(zhì)量的4%～5%[8-9]，可入藥，具有利尿清熱、健脾固腎等功效。研究表明，分心木富含多酚[10]、多糖[11]、黃酮[12]等生物活性成分，可用于化妝品、藥品等中。植物多酚又名植物單寧，為植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝物，具有多元酚結(jié)構(gòu)，具有天然性和光譜抑菌性[13-15]，在食品、藥品、化妝品等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。目前對(duì)植物多酚的研究較多，但對(duì)核桃分心木多酚的研究較少，因此該領(lǐng)域極具研究?jī)r(jià)值。超聲波法是提取天然產(chǎn)物活性成分的一種有效手段，具有耗時(shí)短、成本低、且較傳統(tǒng)提取方法產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[16-17]。本試驗(yàn)以核桃分心木為材料，探究料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響，旨在為分心木的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃：保山市蒲縹鎮(zhèn)；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；石油醚（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉（分析純）：北京試劑有限公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司。

UV5100型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；SB-3200DT超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；TDL5A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分心木多酚提取工藝

分心木干燥后，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，待用。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g分心木粉末，按照一定的料液比加入不同濃度的乙醇，在一定溫度下的超聲波清洗器中提取一定的時(shí)間。提取結(jié)束后，減壓抽濾，收集濾液，采用Folin-Ciocateu[18-19]法測(cè)定提取液中多酚的含量。

1.2.2 多酚得率的計(jì)算

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確配制1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品母液，依次配制質(zhì)量濃度為 0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/mL 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，置于10 mL的試管中，加入0.1 mg/mL福林酚試劑5 mL，充分振搖，靜置2 min，再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，置于陰暗處?kù)o置反應(yīng)60 min，以蒸餾水做空白對(duì)照，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度[20-21]。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.2.2 多酚提取率的計(jì)算

式中：C為提取液中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為樣品提取液定容總體積，mL；V2為量取提取液樣品測(cè)定定容的體積，mL；V3為測(cè)定用樣液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 料液比對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g分心木粉末，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、超聲溫度為60℃、超聲時(shí)間為40 min，選取料液比為 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1∶60、1∶70（g/mL）?？疾炝弦罕葘?duì)分心木多酚提取率的影響。

1.2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比為1 ∶60（g/mL）、超聲溫度為 60℃、超聲時(shí)間為 40 min，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%。考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)分心木多酚提取率的影響。

1.2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比為1∶60（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、超聲溫度為60 ℃，選取超聲時(shí)間為 20、30、40、50、60 min?？疾斐晻r(shí)間對(duì)分心木多酚提取率的影響。

1.2.3.4 超聲溫度對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比為1∶60（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、超聲時(shí)間為50 min，選取超聲溫度為 40、50、60、70、80 ℃。考察超聲溫度對(duì)分心木多酚提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以分心木多酚提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲溫度（D）為自變量，對(duì)核桃分心木多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[22-23]，如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行做3次，結(jié)果取算術(shù)平均值。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件Origin8.5、Design Expert8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

根據(jù)測(cè)定的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在各個(gè)濃度下的吸光度值，計(jì)算得回歸方程為：y=0.009 5x+0.011 7，R2=0.999 2，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最佳料液比的確定

料液比對(duì)多酚提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)多酚提取率的影響Fig.1 The effect of material liquid ratio on extraction rate of polyphenols

由圖1可知，多酚提取率隨著料液比的減小呈上升的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著溶劑的增加多酚的溶解度增加。當(dāng)料液比為1∶60（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最高，隨后下降，分析原因可能是溶劑過(guò)多，非多酚物質(zhì)溶出導(dǎo)致提取率下降[24]?？紤]成本等因素，確定料液比為1 ∶60（g/mL）最優(yōu)。

2.2.2 最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，多酚提取呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，多酚得率達(dá)到最大。造成這種現(xiàn)象的原因可能是：乙醇體積分?jǐn)?shù)太高時(shí)，分心木提取液中的醇溶性雜質(zhì)會(huì)溶出，影響多酚在乙醇溶液中的溶解，所以綜上所述，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%最優(yōu)。

2.2.3 最佳超聲時(shí)間的確定

超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols

從圖3可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，多酚提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為50 min的時(shí)候，多酚提取率達(dá)到最大。分析可能有以下原因[25]：一是分心木細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，胞內(nèi)的其他成分溶出；二是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致多酚的機(jī)構(gòu)被破壞。因此超聲提取時(shí)間選擇50 min。

2.2.4 最佳超聲溫度的確定

超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on extraction rate of polyphenols

由圖4可知，隨著超聲提取溫度的升高，提取率逐漸提高，當(dāng)超聲提取溫度為70℃時(shí)，多酚提取率最高，隨后下降，可能是由于溫度過(guò)高，多酚的結(jié)構(gòu)被破壞。所以超聲溫度選擇為70℃。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以核桃分心木多酚提取率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲溫度（D）為影響因素得出試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of response surface test

對(duì)表2中的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸分析，得擬合方程為：Y＝6.99+0.18A-0.096B+0.067C+0.27D+0.052AB-0.014AC+0.012AD+0.084BC+0.18BD-6.625×10-3CD-0.26A2-0.30B2-0.42C2-0.77D2。

2.3.2 方差分析

以A、B、C、D為自變量，以分心木多酚提取率Y為響應(yīng)變化值，運(yùn)用Design-Expert8.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果如表3所示。

從表3可知，模型的P值達(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)P＝0.1171>0.05，不顯著，說(shuō)明模型擬合度較好。決定系數(shù)R2adj為0.989 1，說(shuō)明該模型能解釋98.91%響應(yīng)值的變化，因此可用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)分心木中多酚的提取。根據(jù)F值的大小得出各因素對(duì)響應(yīng)值影響順序?yàn)椋篋>A>B>C。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.3.3 各因素間交互作用分析

通過(guò)Design Expert8.0軟件可以做出響應(yīng)面曲線圖，分析超聲提取溫度、料液比、超聲提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素的交互作用對(duì)分心木多酚提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5～圖10。

圖5 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ethanol concentration

圖6 料液比和超聲時(shí)間的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ultrasonic time

圖7 料液比和超聲溫度的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ultrasonic temperature

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間的響應(yīng)曲面和等高線Fig.8 The response surface and contour figure about ethanol concentration and ultrasonic time

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度的響應(yīng)曲面和等高線Fig.9 The response surface and contour figure about ethanol concentration and ultrasonic temperature

圖10 超聲時(shí)間和超聲溫度的響應(yīng)曲面和等高線Fig.10 The response surface and contour figure about ultrasonic time and ultrasonic temperature

從響應(yīng)面3D圖的坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀可以看出四因素之間交互作用的強(qiáng)弱，響應(yīng)面3D圖的坡度越平緩，說(shuō)明因素對(duì)響應(yīng)值的影響不大，相反，響應(yīng)面3D圖的坡度越陡峭，說(shuō)明素對(duì)響應(yīng)值的影響較大；等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓則與之相反。

從圖5～圖10可知料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度的等高線趨于橢圓，說(shuō)明它們之間的交互作用明顯；料液比與超聲時(shí)間、料液比與超聲溫度、超聲時(shí)間與超聲溫度的等高線趨于圓形，說(shuō)明它們之間的交互作用不明顯。

2.4 最佳工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面回歸模型方程分析，得出最優(yōu)提取條件為：料液比1∶61.74（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)49.65%、超聲時(shí)間50.34 min、超聲溫度70.83℃、提取率為7.04%。根據(jù)實(shí)際情況，將提取條件修正為：料液比1 ∶62（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%、超聲時(shí)間 50 min、超聲溫度71℃，并進(jìn)行3次試驗(yàn)，結(jié)果取平均值為6.98%，實(shí)際所測(cè)的平均值和預(yù)測(cè)值相差-0.01%，表明試驗(yàn)結(jié)果與模型符合較好，可靠性較高。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取核桃分心木多酚提取的最佳條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1∶62（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度71℃，多酚提取率6.98%。