高濤，羅振宇，羅黃洋，秦巧玲，唐華麗

（重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶萬(wàn)州404100）

川明參又名沙參、明沙參、土明參，主產(chǎn)于四川、湖北等地，其根可入藥，常作為滋補(bǔ)物品加入食物以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]。川明參所含化學(xué)成分中以多糖含量較高，其含量在20%以上[3]。此外，研究表明，川明參多糖（Chuanmingshen violaceum polysaccharides，CVP） 具有抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)免疫、潤(rùn)肺化痰及抗菌等生理活性[4-6]，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景，因此如何有效提高CVP提取率顯得十分重要。

當(dāng)前CVP的提取多采用熱水浸提法或熱回流法，此兩種方法具有能耗高，耗時(shí)長(zhǎng)，高溫易影響多糖活性等不足[7]，實(shí)際操作中常采用其它輔助方法對(duì)CVP進(jìn)行提取優(yōu)化，但提取效果均不理想[8-10]。近年來(lái)酶解和超聲波輔助提取法被廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取中，具有專(zhuān)一性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷且不影響有效成分活性等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，而將酶法和超聲技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于CVP的提取尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用超聲輔助酶法提取川明參中的多糖成分，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝，為CVP的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川明參、氫氧化鈉、乙酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚（分析純）：重慶萬(wàn)州國(guó)藥集團(tuán)；纖維素酶（100 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司。

200Y不銹鋼中藥粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；KQ-300B超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；YY/T0657-200離心機(jī)：湖南平凡科技有限公司；UV2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、FT-IR-8400S傅立葉變換紅外光譜儀：日本島津有限公司；YRE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DZF-6050M電熱恒溫真空干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；ALPHA1-2/LD-plus冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；ME204E分析天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CVP提取工藝

川明參→挑選去雜→干燥→粉碎→過(guò)篩→超聲輔助酶法提取→過(guò)濾→濾液濃縮→醇沉→離心→洗滌沉淀→冷凍干燥→粗多糖

稱(chēng)取一定量川明參粉（質(zhì)量記為M0）置于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，同時(shí)加入一定量纖維素酶，調(diào)節(jié)混合液pH值，設(shè)定超聲功率、溫度和時(shí)間，提取、過(guò)濾，濾液濃縮至原體積約1/4，加入3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，靜置過(guò)夜，離心，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚洗滌，再次離心，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥即為川明參粗多糖（質(zhì)量記為N）。

1.2.2 CVP提取率測(cè)定

以葡萄糖為參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用苯酚-硫酸法測(cè)定川明參粗多糖中的多糖含量M1，并按公式計(jì)算川明參多糖的提取率。

式中：N為川明參粗多糖的質(zhì)量，g；M0為川明參粉末的質(zhì)量，g；M1為川明參粗多糖中的多糖含量，%。

1.2.3 多糖提取單因素試驗(yàn)

在固定料液比 1∶20（g/mL），超聲功率 300 W，提取溫度60℃，提取時(shí)間30 min，pH4的條件下，考查纖維素酶用量分別為 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g 時(shí)的CVP提取率。

在固定料液比 1∶20（g/mL），超聲功率 300 W，提取溫度60℃，提取時(shí)間30 min，纖維素酶用量0.20 g的條件下，考查pH值分別為2、3、4、5、6時(shí)的CVP提取率。

在固定料液比 1∶20（g/mL），超聲功率 300 W，提取時(shí)間30 min，纖維素酶用量0.20 g，pH4的條件下，考查提取溫度分別為 35、40、45、50、55 ℃時(shí)的 CVP 提取率。

在固定料液比 1∶20（g/mL），超聲功率 300 W，提取溫度60℃，纖維素酶用量0.20 g，pH4的條件下，考查提取時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 min 下的 CVP 提取率。

根據(jù)各因素的最適取值確定后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的水平范圍。

1.2.4 多糖提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取酶用量（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、pH值（D）4個(gè)因素為自變量，以CVP提取率值為響應(yīng)值（Y），利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)0點(diǎn)。各因素變化區(qū)間根據(jù)單因素試驗(yàn)確定，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)做3個(gè)重復(fù)，取平均值。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平表Table 1 The table of level for test factors

1.2.5 CVP的紅外光譜分析

取干燥的CVP樣品1 mg～2 mg，與適量干燥KBr粉末混合，在瑪瑙研缽中研磨均勻，經(jīng)壓片后，用傅里葉紅外光光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）在波數(shù)400 cm-1～4 000 cm-1范圍掃描并記錄光譜[14]。

1.2.6 CVP對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定

分別取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL于試管中，分別加入8×10-4mol/L的DPPH溶液2 mL，搖勻，待暗處反應(yīng)0.5 h后，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A，按公式計(jì)算CVP對(duì)DPPH·的清除率[15-16]。

式中：A樣品為加入CVP樣品溶液的吸光度；ADPPH為不加入樣品的溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2018計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析，Origin 2018繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

苯酚-硫酸法中，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y＝16.51x-0.160 4，其 R2＝0.999 2，表明葡萄糖濃度與吸光度之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算川明參粗多糖中的多糖含量。

2.2 單因素試驗(yàn)

纖維素酶用量、提取溫度、提取時(shí)間及pH值對(duì)川明參多糖提取率的影響如圖1所示。

圖1 各因素對(duì)CVP提取率的影響Fig.1 Effect of various factors on the extraction rate of CVP

在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)，纖維素酶用量（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）和 pH 值（D）均對(duì) CVP提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)。纖維素酶具有破壞植物細(xì)胞壁、分解纖維素，從而加速植物細(xì)胞內(nèi)容物溶出的作用[15]，用量太少不足以破壞川明參的細(xì)胞壁使多糖溶出，而多余的酶可能會(huì)導(dǎo)致CVP水解；溫度的提高有利于多糖的溶出，但溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致酶的失活以及多糖活性的破壞；提取時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)有利于CVP的有效溶出；pH值可通過(guò)對(duì)酶活性中心上必需基團(tuán)的解離水平調(diào)節(jié)影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化，只有在適宜pH值條件下，酶反應(yīng)速度才能達(dá)到最大值。綜合考慮，選取纖維素酶用量0.25 g、提取溫度50℃、提取時(shí)間40 min和pH 4進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化CVP提取工藝

2.3.1 模型的建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)CVP提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以CVP提取率為評(píng)定指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results of response surface

利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析與擬合后得到各因素與川明參多糖提取率（Y）的回歸方程為：Y=49.648-0.045A+0.612B+0.311C+0.374D+0.153AB+0.503AC+0.065AD+0.095BC+0.163BD+0.545CD-0.910A2-0.450B2-1.001C2-1.322D2。

采用Design-Expert 8.0.6對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸方程的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance and significance test of regression equation

模型的P＝0.000 5＜0.01，表明回歸模型極顯著，可信性高。失擬項(xiàng)P＝0.256 7＞0.05，表明方差失擬項(xiàng)不顯著，非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大。另外，所選模型的R2為0.908 1，表明該模型能解釋90.81%的結(jié)果值的變化規(guī)律，基本可用于超聲輔助酶法提取CVP的分析與預(yù)測(cè)。同時(shí)，一次項(xiàng) B 和平方項(xiàng)A2、C2、D2對(duì)CVP 提取率具有極顯著影響（P＜0.01）；一次項(xiàng)C、D和交互項(xiàng)AC、CD對(duì)CVP提取率具有顯著影響（P＜0.05）。此外，由各因素的F值大小可知，各因素對(duì)CVP提取率影響的強(qiáng)弱程度依次為B>D>C>A。

以響應(yīng)面分析的回歸方程為基礎(chǔ)，并利用Origin 2018繪制具有顯著性差異（AC和CD）的兩因素交互作用的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線(xiàn)圖Fig.2 Response surface and contour diagram of the interaction of various factors

由圖2可知，纖維素酶用量與提取時(shí)間、提取時(shí)間與pH值之間交互作用顯著。響應(yīng)面的陡峭程度分析發(fā)現(xiàn)，提取溫度對(duì)CVP提取率的影響最大，其次是提取pH值和提取時(shí)間，與方差分析結(jié)果一致。

2.3.2 最佳提取工藝確定

采用Design-Expert 8.0.6軟件預(yù)測(cè)超聲輔助酶法提取川明參多糖的最佳工藝參數(shù)。其結(jié)果為纖維素酶用量0.26 g，提取溫度53.89℃，提取時(shí)間42.93 min，酶解pH值為4.20，此條件下CVP的提取率最高，預(yù)測(cè)值為49.98%。為方便試驗(yàn)，在纖維素酶用量為0.26 g，提取溫度為54℃，提取時(shí)間為43 min和pH值為4.20的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。上述試驗(yàn)條件下得到的川明參多糖的提取率為（49.52±0.53）%，與理論預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明用該模型可以較好地反映出CVP提取的條件。

2.4 CVP的FT-IR分析

采用傅里葉紅外光譜儀對(duì)川明參多糖的紅外光譜進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 CVP的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectroscopy of CVP

由圖3可知，3 400 cm-1附近處的強(qiáng)吸收峰是-OH的伸縮振動(dòng)，表明CVP中存在分子間和分子內(nèi)氫鍵[17]。2 900 cm-1附近的吸收峰是糖類(lèi)C-H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰[18]。1 640 cm-1附近處的強(qiáng)吸收峰可能是-CHO的-C＝O伸縮振動(dòng)造成的，表明CVP中可能含有糖醛酸[19]；1 400 cm-1～1 200 cm-1區(qū)域內(nèi)的一組吸收峰是C-H 的變角振動(dòng)峰[20]；1 200 cm-1～1 000 cm-1區(qū)域內(nèi)的3個(gè)吸收峰是由兩種-C-O伸縮振動(dòng)所引起的，其中一種是疏水性C-O-H引起，另一種是由吡喃糖環(huán)的-CO-C-所引起[21]；930 cm-1附近處的弱吸收峰可能是吡喃糖環(huán)的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)所引起的[22]。840 cm-1左右的吸收峰表明CVP含有α-糖苷鍵[23]；紅外數(shù)據(jù)表明CVP的單糖殘基為α-吡喃糖型。

2.5 CVP的抗氧化活性

粗CVP對(duì)DPPH·的清除作用見(jiàn)圖4。

圖4 粗CVP對(duì)DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of crude CVP on DPPH·

如圖4所示。隨著CVP質(zhì)量濃度增大，其對(duì)DPPH·清除率也隨之升高，表明在一定范圍內(nèi)，CVP的抗氧化活性與其含量呈劑量效應(yīng)關(guān)系，此外，在一定范圍內(nèi)，CVP的DPPH自由基清除能力與VC比較接近，但其DPPH自由基清除能力還是低于VC。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)確定了超聲輔助酶法提取CVP工藝?yán)w維素酶用量、提取溫度、提取時(shí)間及pH值的最適范圍，在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化CVP的最佳工藝條件。結(jié)果表明，各因素對(duì)CVP提取率影響大小順序?yàn)樘崛囟龋咎崛H值＞提取時(shí)間＞纖維素酶用量，CVP的最佳提取條件纖維素酶用量為0.26 g，提取溫度為54℃，提取時(shí)間為43 min和pH值為4.20，此條件下CVP的提取率為（49.52±0.53）%，與理論預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明用該模型可以較好地優(yōu)選出CVP提取的條件。CVP的紅外光譜圖顯示有多個(gè)具有多糖特征的官能團(tuán)存在，分析表明CVP中可能有吡喃糖殘基的存在。通過(guò)CVP對(duì)DPPH·的清除能力測(cè)定，結(jié)果表明在設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，CVP具有較明顯的抗氧化活性。