張智成，楊清泉

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大最常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］。每年全球約有90 萬(wàn)人死于CRC［2］。在我國(guó)，由于生活方式和飲食習(xí)慣的改變，CRC 已成為迅速增加的惡性腫瘤之一［3］。目前，盡管通過(guò)外科手術(shù)結(jié)合輔助化療、靶向藥物等手段提高了CRC 患者生存率，但控制腫瘤局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是難題。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一類(lèi)新型的非編碼RNA，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，在基因表達(dá)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用［4］。作為L(zhǎng)ncRNA 家族成員之一，LncRNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（MALAT1）在結(jié)直腸癌、食管癌等多種胃腸道腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，具有重要的調(diào)控作用。LncRNA 分子內(nèi)富含微小RNA（miRNA）結(jié)合位點(diǎn)，可以作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA（ceRNA），在細(xì)胞中起到分子海綿的作用，介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展，使得LncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有望成為CRC 診斷與治療的分子靶點(diǎn)［5］。本研究通過(guò)檢測(cè)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與CRC 細(xì)胞株中LncRNA-MALAT1、miR-142-3p 與TEA 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1（TEA domain transcription factor 1，TEAD1）的表達(dá)水平，探討LncRNA-MALAT1能否通過(guò)與miR-142-4p結(jié)合，進(jìn)而影響其潛在靶基因TEAD1蛋白水平的表達(dá)，調(diào)控CRC細(xì)胞的增殖與凋亡，影響CRC的病理進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 細(xì)胞、SW480 細(xì)胞、DLD-1 細(xì)胞、Caco-2 細(xì)胞以及McCoy′s 5A 培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC細(xì)胞購(gòu)自上海青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基與DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，Bax 兔多克隆抗體、Bcl-2 兔多克隆抗體、β-actin 兔多克隆抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，CyclinD1兔單克隆抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，TEAD1兔多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)Affinity Biosciences 公司，TRIpure 購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，SYBR Green I 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，

si-MALAT1 及陰性對(duì)照si-NC 片段、miR-142-3p mimic 及陰性對(duì)照NC mimic 片段、miR-142-3p inhibitor 及陰性對(duì)照NC inhibitor 片段購(gòu)自武漢金拓思生物科技有限公司，MALAT1-wtUTR、 MALAT1-mutUTR、 TEAD1-wtUTR 與 TEAD1-mutUTR載體購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。熒光定量PCR 儀購(gòu)自韓國(guó)BIONEER 公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN 公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)艾森生物公司，倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS 公司，電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116 細(xì)胞使用含10% 胎牛血清的McCoy′s 5A培養(yǎng)基，SW480細(xì)胞與DLD-1細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，Caco-2 細(xì)胞使用含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，F(xiàn)HC 細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 細(xì)胞、SW480 細(xì)胞、DLD-1 細(xì)胞與Caco-2 細(xì)胞以及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC細(xì)胞，設(shè)置為HCT116組、SW480組、DLD-1組、FHC 組與Caco-2組；選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，分別使用si-NC 片段、si-MALAT1片段、si-MALAT1片段+NC inhibitor 或si-MALAT1 片段+miR-142-3p inhibitor 共轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞，另設(shè)置不進(jìn)行轉(zhuǎn)染僅進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)的HCT116 細(xì)胞組別，即si-NC 組、si-MALAT1 組、si-MALAT1+NC inhibitor 組、si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor 組 與Control組。

1.4 Real-time PCR 檢測(cè)LncRNA-MALAT1與miR-142-3p基因的表達(dá) 通過(guò)TRIpure提取各組細(xì)胞總RNA，將1 μg RNA加入至20 μL 混合反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄至cDNA，采用ExicyclerTM96 熒光定量PCR 儀進(jìn)行Real-time PCR 檢測(cè)與分析。引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系20 μL：cDNA 模板1 μL，上下游 引物（10 μmol/L）各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，ddH2O 8 μL。LncRNA-MALAT1基因檢測(cè)反應(yīng)條件：94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；miR-142-3p基因檢測(cè)反應(yīng)條件：94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)。miR-142-3p基因檢測(cè)以U6基因作為內(nèi)參，LncRNA-MALAT1基因檢測(cè)以β-actin基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 Western blot檢測(cè)TEAD1、Bax、Bcl-2與Cyclin D1蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取40 μg蛋白上樣，采用12%或15%分離膠，5%濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗TEAD1 抗 體（1∶1 000）、Bax 抗 體（1∶500）、Bcl-2 抗 體（1∶500）、Cyclin D1抗體（1∶1 000）和β-actin抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌后加入二抗羊抗兔IgG-HRP（1∶5 000），37 ℃孵育45 min，ECL 法檢測(cè)。用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer 軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度（OD）值。

Tab.1 Real-time PCR primer sequences表1 Real-time PCR引物序列

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔密度接種至96孔板，待細(xì)胞貼壁后，按1.3分組轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理0、24、48、72 h 后，上述HCT116 細(xì)胞每孔更換為100 μL 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的OD值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，以4×105個(gè)/孔密度接種至6 孔板，待細(xì)胞貼壁后，各轉(zhuǎn)染組設(shè)置同1.3 組。各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理48 h 后，同步收集上述各組細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液，輕輕重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL Propidium Iodide，混勻后室溫避光孵育10～20 min，流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-142-3p 與TEAD1的結(jié)合 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，分別使 用1.5 μg MALAT1-wtUTR 質(zhì) 粒（野 生 型）、1.5 μg MALAT1-mutUTR 質(zhì)粒（突變型）與25 pmol NC mimic 或25 pmol miR-142-3p mimic 片 段 共 轉(zhuǎn) 染HCT116 細(xì) 胞，即MALAT1-wtUTR+NC mimic 組、MALAT1-mutUTR+NC mimic組、MALAT1-wtUTR+miR-142-3p mimic 組 與MALAT1-mutUTR+miR-142-3p mimic 組；分別使用TEAD1-wtUTR 質(zhì)粒（野生型）或TEAD1-mutUTR 質(zhì)粒（突變型）與NC mimic 或miR-142-3p mimic 片段共轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞，即TEAD1-wtUTR+NC mimic 組、TEAD1-mutUTR+NC mimic 組、TEAD1-wtUTR+miR-142-3p mimic 組與TEAD1-mutUTR+miR-142-3p mimic組。上述各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，根據(jù)其說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad prism 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。多組間比較采用單因素方差分析，并通過(guò)Tukey法進(jìn)行校正；組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞中LncRNA-MALAT1、miR-142-3p基因與TEAD1 蛋白的表達(dá)變化 與人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC 細(xì)胞相比，結(jié)直腸癌細(xì)胞株（SW480、DLD-1、HCT116 與Caco-2 細(xì)胞）中LncRNA-MALAT1基因、TEAD1 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），miR-142-3p基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)直腸癌細(xì)胞株中HCT116 細(xì)胞LncRNA-MALAT1表達(dá)量相對(duì)較高，故用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。見(jiàn)圖1、表2。

Fig.1 The expression of TEAD1 in human normal colon epithelial cells and colorectal cancer cell lines圖1 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞TEAD1表達(dá)

Tab.2 The expression levels of LncRNA-MALAT1,miR-142-3p and TEAD1 in human normal colon epithelial cells and colorectal cancer cell lines表2 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞LncRNAMALAT1、miR-142-3p基因與TEAD1蛋白表達(dá)水平（n=3，±s）

Tab.2 The expression levels of LncRNA-MALAT1,miR-142-3p and TEAD1 in human normal colon epithelial cells and colorectal cancer cell lines表2 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞LncRNAMALAT1、miR-142-3p基因與TEAD1蛋白表達(dá)水平（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與FHC組比較，P＜0.05

組別FHC組SW480組DLD-1組HCT116組Caco-2組F LncRNA-MALAT1 1.00±0.03 2.61±0.25a 1.72±0.05a 3.56±0.29a 2.65±0.24a 71.150＊＊miR-142-3p 1.00±0.04 0.30±0.02a 0.56±0.04a 0.25±0.02a 0.40±0.03a 277.700＊＊TEAD1 1.00±0.09 4.10±0.33a 2.05±0.21a 5.06±0.36a 4.33±0.32a 110.900＊＊

2.2LncRNA-MALAT1對(duì)TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2與Bax 蛋白表達(dá)的影響 與si-NC 組細(xì)胞相比，si-MALAT1 組細(xì)胞Bax 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，TEAD1 蛋白、Bcl-2 蛋白與Cyclin D1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

2.3LncRNA-MALAT1通過(guò)miR-142-3p調(diào)控下游蛋白以及細(xì)胞增殖與凋亡 Control 組、si-NC 組、si-MALAT1 組、si-MALAT1+NC inhibitor 組、si-MALAT1+miR-142- 3p inhibitor 組凋亡率分別為（4.15±0.05）% 、（4.29±0.06）% 、（15.38±0.29）% 、（14.22±0.72）% 和（5.85±0.43）%（n=3，F(xiàn)=582.400，P＜0.01）。與si-NC 組細(xì)胞相比，si-MALAT1 組細(xì)胞miR-142-3p基因、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.05），LncRNA-MALAT1基因、TEAD1 蛋白、Bcl-2 蛋白、Cyclin D1 蛋白相對(duì)表達(dá)量，48、72 h細(xì)胞增殖水平顯著下降（P＜0.05）；與si-MALAT1+NC inhibitor 組細(xì)胞相比，si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor 組細(xì)胞miR-142-3p基因、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），LncRNA-MALAT1基 因、TEAD1 蛋 白、Bcl-2 蛋白、Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量，48、72 h細(xì)胞增殖水平顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、4，表4、5。

2.4 LncRNA-MALAT1 與miR-142-3p 以及TEAD1與miR-142-3p 靶向結(jié)合驗(yàn)證 MALAT1-wtUTR+NC mimic 組、MALAT1-mutUTR+NC mimic 組、MALAT1-wtUTR+miR-142 -3p mimic 組、MALAT1-mutUTR+miR-142 -3p mimic 組相對(duì)熒光素酶活性分別為1.00±0.10、1.07±0.12、0.57±0.06和0.97±0.12，與MALAT1-wtUTR+NC mimic 組細(xì)胞相比，MALAT1-wtUTR+miR-142-3p mimic 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著下降（n=3，F(xiàn)=14.550，P＜0.01）；TEAD1-wtUTR+NC mimic 組、TEAD1-mutUTR+NC mimic 組、TEAD1-wtUTR+miR-142 -3p mimic 組和TEAD1-mutUTR+miR-142-3p mimic 組相對(duì)熒光素酶活性分別為1.00±0.11、0.95±0.14、0.55±0.06 和0.99±0.10，與TEAD1-wtUTR+NC mimic 組 細(xì) 胞 相比，TEAD1-wtUTR+miR-142-3p mimic 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著下降（n=3，F(xiàn)=12.070，P＜0.01）。

Fig.2 The expressions of TEAD1,Cyclin D1,Bcl-2 and Bax in three groups of HCT116 cells圖2 各組HCT116細(xì)胞TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2與Bax表達(dá)

Tab.3 The expression levels of TEAD1,Cyclin D1,Bcl-2 and Bax in three groups of HCT116 cells表3 各組HCT116細(xì)胞TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2與Bax表達(dá)水平（n=3，±s）

Tab.3 The expression levels of TEAD1,Cyclin D1,Bcl-2 and Bax in three groups of HCT116 cells表3 各組HCT116細(xì)胞TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2與Bax表達(dá)水平（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與si-NC組比較，P＜0.05

組別Control組si-NC組si-MALAT1組F TEAD1 1.00±0.08 1.01±0.04 0.40±0.05a 116.400＊＊Cyclin D1 1.00±0.00 0.98±0.03 0.56±0.00a 871.000＊＊Bcl-2 1.00±0.02 0.99±0.02 0.39±0.01a 1 506.000＊＊Bax 1.00±0.04 0.94±0.05 3.38±0.08a 1 805.000＊＊

Fig.3 The expressions of TEAD1,Cyclin D1,Bcl-2 and Bax in four groups of HCT116 cells圖3 各組HCT116細(xì)胞TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2與Bax表達(dá)

3 討論

LncRNA 是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸（nt）且不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子［6］。作為L(zhǎng)ncRNA家族成員，LncRNA-MALAT1 首先被發(fā)現(xiàn)于早期非小細(xì)胞肺癌，與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-MALAT1 在多種腫瘤中高表達(dá)，能夠作為腫瘤標(biāo)志物，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。相關(guān)研究報(bào)道，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，LncRNA-MALAT1能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-143-3p，促進(jìn)miR-143-3p 靶基因黑色素瘤抗原家族成員A9（melanoma antigen family member A9，MAGEA9）的表達(dá)，促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖與遷移［7］。在卵巢癌中，LncRNA-MALAT1 能夠通過(guò)活化Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，提升卵巢癌細(xì)胞的生存與轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展［8］。有研究報(bào)道，LncRNAMALAT1 在CRC 組織中呈高表達(dá)，且對(duì)CRC 細(xì)胞具有重要的調(diào)控作用，促進(jìn)CRC 的病理進(jìn)程［9］。本研究顯示，LncRNA-MALAT1能夠促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖，并抑制CRC細(xì)胞凋亡，起到提升CRC細(xì)胞生存能力的調(diào)控作用，促進(jìn)CRC 的發(fā)生與發(fā)展，這與LncRNA-MALAT1在腫瘤中調(diào)控作用的相關(guān)研究結(jié)果一致。

Fig.4 Comparison of apoptosis rates between four groups of HCT116 cells圖4 各組HCT116細(xì)胞凋亡率比較

Tab.4 The expression levels of LncRNA-MALAT1 and miR-142-3p in four groups of HCT116 cells表4 各組HCT116 細(xì)胞LncRNA-MALAT1、miR-142-3p、TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2與Bax表達(dá)水平（n=3，±s）

Tab.4 The expression levels of LncRNA-MALAT1 and miR-142-3p in four groups of HCT116 cells表4 各組HCT116 細(xì)胞LncRNA-MALAT1、miR-142-3p、TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2與Bax表達(dá)水平（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與si-NC 組比較，b與si-MALAT1+NC inhibitor 組比較，P＜0.05

組別si-NC組si-MALAT1組si-MALAT1+NC inhibitor組si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor組F LncRNAMALAT1 1.08±0.03 0.21±0.02a 0.20±0.02 0.82±0.07b miR-142-3p 1.01±0.08 4.35±0.14a 4.24±0.13a 1.18±0.04b TEAD1蛋白1.00±0.07 0.52±0.04a 0.51±0.06 0.74±0.06b 399.500＊＊1 034.000＊＊47.560＊＊組別si-NC組si-MALAT1組si-MALAT1+NC inhibitor組si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor組F Cyclin D1蛋白1.00±0.01 0.50±0.01a 0.52±0.01 0.79±0.03b Bcl-2蛋白1.00±0.02 0.39±0.01a 0.38±0.06 0.73±0.05b Bax蛋白1.00±0.05 3.57±0.12a 3.56±0.05 1.94±0.06b 801.700＊＊161.800＊＊908.800＊＊

Tab.5 Comparison of proliferation ability between four groups of HCT116 cells表5 各組HCT116細(xì)胞增殖能力比較（n=3，OD值，±s）

Tab.5 Comparison of proliferation ability between four groups of HCT116 cells表5 各組HCT116細(xì)胞增殖能力比較（n=3，OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與si-NC 組比較，b與si-MALAT1+NC inhibitor 組比較，P＜0.05

組別Contol組si-NC組si-MALAT1組si-MALAT1+NC inhibitor組si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor組F 0 h 0.23±0.03 0.26±0.04 0.26±0.04 0.24±0.03 24 h 0.49±0.08 0.45±0.05 0.40±0.04 0.41±0.05 48 h 0.77±0.08 0.81±0.07 0.60±0.07a 0.55±0.07 72 h 1.01±0.12 1.09±0.13 0.73±0.10a 0.68±0.08 0.26±0.03 0.48±0.06 0.73±0.10b 0.98±0.12b 0.562 2.719 10.040＊＊14.420＊＊

LncRNA 可作為miRNA 的分子海綿，通過(guò)吸附miRNA，削弱miRNA 對(duì)mRNA 的靶向調(diào)控作用［10］。miRNA是一類(lèi)小的單鏈非編碼RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種原癌基因與抑癌基因的表達(dá)［11］。研究顯示，作為miRNA 家族中的一員，miR-142-3p 在腫瘤疾病中能夠發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在胃癌中，miR-142-3p 能夠靶向抑制細(xì)胞周期蛋白T2（CCNT2）的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，抑制胃癌的病理進(jìn)程［12］；在乳腺癌中，miR-142-3p 能夠被LncRNA-NNTAS1 吸附，導(dǎo)致E 盒結(jié)合鋅指蛋白1（ZEB1）表達(dá)升高，進(jìn)而提升乳腺癌細(xì)胞的生存與轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展［13］；而在CRC 中，miR-142-3p 的下調(diào)提示CRC 的發(fā)生，且miR-142-3p可以作為腫瘤抑制因子，對(duì)抑制CRC發(fā)生與發(fā)展起到重要調(diào)控作用［14-15］。本研究顯示，LncRNA-MALAT1 能夠結(jié)合miR-142-3p，可以作為miR-142-3p 的分子海綿，通過(guò)吸附miR-142-3p，促進(jìn)CRC 細(xì)胞增殖，并抑制CRC 細(xì)胞凋亡，調(diào)控CRC的病理進(jìn)程，與既往研究結(jié)果相吻合。

miRNA 能夠通過(guò)與靶mRNA 的3′非編碼區(qū)（3′UTR）互補(bǔ)結(jié)合，在不影響靶mRNA 穩(wěn)定性的情況下，阻遏靶mRNA的翻譯進(jìn)程，進(jìn)而參與調(diào)控腫瘤的病理進(jìn)程［11］。本研究結(jié)果顯示，miR-142-3p 與TEAD1 存在靶向關(guān)系。TEAD1 是一種重要的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子，隸屬于TEF 蛋白家族，可以與yes 相關(guān)蛋白（YAP）形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，并通過(guò)參與到Hippo信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞的生存能力具有重要的調(diào)控作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中，TEAD1 均能夠發(fā)揮重要的調(diào)控作用；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，TEAD1呈高表達(dá)，能夠作為原癌基因，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生與發(fā)展［17］。在骨肉瘤中，抑制TEAD1表達(dá)能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的生存能力與轉(zhuǎn)移能力［18］。而在CRC 中，TEAD1 表達(dá)的升高能夠引起CRC 細(xì)胞增殖水平的升高［19］。本研究顯示，作為miR-142-3p的靶基因，當(dāng)LncRNA-MALAT1吸附miR-142-3p后，TEAD1 表達(dá)水平顯著升高，能夠促進(jìn)CRC 細(xì)胞增殖，抑制CRC細(xì)胞凋亡。

Cyclin D1 是一種細(xì)胞周期蛋白，能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）4或CDK6在G1期結(jié)合形成復(fù)合物，再通過(guò)N末端LECXF 基序與成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）結(jié)合，使pRb的絲氨酸和酪氨酸殘基磷酸化，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而當(dāng)Cyclin D1 表達(dá)失控時(shí)，將引起細(xì)胞增殖周期失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［20］。Bcl-2 原癌基因與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。有研究顯示Bcl-2可能通過(guò)抗氧化作用阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，影響線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C 發(fā)揮抗凋亡的作用［21］。Bax 基因是Bcl-2 基因族內(nèi)的同源基因，其編碼的Bax 蛋白與Bcl-2 蛋白具有21%的同源性，然而B(niǎo)ax對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用與Bcl-2 截然相反。Bax 可能通過(guò)破壞線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換、氧化磷酸化和腺苷三磷酸合成功能改變細(xì)胞氧化還原作用，激活凋亡信號(hào)caspase 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程［21］。Cyclin D1 與Bcl-2 蛋白表達(dá)的升高以及Bax 蛋白表達(dá)的降低能夠促進(jìn)CRC 的發(fā)生與發(fā)展，而抑制Cyclin D1 與Bcl-2 蛋白表達(dá)或促進(jìn)Bax 蛋白的表達(dá)能夠促進(jìn)CRC 細(xì)胞凋亡，抑制CRC 細(xì)胞增殖，對(duì)CRC的病理進(jìn)程起到一定的緩解作用［22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制LncRNA-MALAT1基因表達(dá)能夠抑制Cyclin D1 與Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax 蛋白的表達(dá)；而在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步抑制miR-142-3p的表達(dá)，能夠部分逆轉(zhuǎn)抑制LncRNA-MALAT1基因表達(dá)所引起的Cyclin D1、Bcl-2 與Bax 蛋 白 表 達(dá) 的 變 化，表 明LncRNA-MALAT1能夠通過(guò)miR-142-3p調(diào)控Cyclin D1、Bcl-2 與Bax 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響CRC 細(xì)胞的增殖與凋亡，對(duì)CRC起到一定的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，LncRNA-MALAT1能夠通過(guò)與miR-142-3p結(jié)合，促進(jìn)miR-142-3p靶基因TEAD1 的表達(dá)，促進(jìn)CRC 細(xì)胞增殖，抑制凋亡。本研究闡明了LncRNA-MALAT1/ miR-142-3p/TEAD1 分子軸在CRC 中的作用與調(diào)控機(jī)制，為L(zhǎng)ncRNA-MALT1 在CRC等腫瘤疾病中的作用與機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)。LncRNA-MALAT1/miR-142-3p/TEAD1 分子軸有望成為CRC 早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物，針對(duì)LncRNA-MALAT1/miR-142-3p/TEAD1 分子軸的靶向治療亦可能成為緩解CRC 等腫瘤的新手段。