劉朝暉，馬劍雄，田愛現(xiàn)，孫曉雷，張楊，郭悅，馬信龍△

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量降低與骨微結(jié)構退化為特征的運動系統(tǒng)疾病，骨折是其最常見的并發(fā)癥［1］。預計到2050年，我國骨質(zhì)疏松癥患者將增至599萬例，相關治療費用將高達254.3億美元［2］。因此，OP的防治具有重要的社會意義。

破骨細胞起源于造血干細胞，由單核細胞融合分化而成，是唯一具有骨吸收功能的細胞，其分泌的組織蛋白酶K（CK）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是破骨細胞降解骨基質(zhì)的重要蛋白水解酶［3］。破骨細胞具有獨特的細胞器分布和質(zhì)膜結(jié)構域，與骨組織接觸的細胞膜區(qū)域通過特殊的黏附結(jié)構形成封閉區(qū)，其間的細胞膜具有微絨毛結(jié)構樣褶皺緣，兩者形成相對獨立的骨吸收間隙，完成細胞極化［4］。整合素（integrin）是細胞表面受體超家族蛋白，調(diào)節(jié)黏附、遷移及封閉區(qū)的形成，對破骨細胞分化和激活具有重要意義［5-6］。非受體酪氨酸激酶（c-src）是一種原癌基因，c-src及其磷酸化產(chǎn)物p-src調(diào)節(jié)細胞極化、遷移及褶皺緣的形成，敲除c-src的小鼠體內(nèi)破骨細胞無法形成正常偽足，導致小鼠患骨硬化癥［7-8］。

骨碎補是治療OP的主要中藥之一，具有不良反應小，療效明顯等優(yōu)點，其主要有效成分是雙氫黃酮類單體柚皮苷。有關柚皮苷抗OP 的分子機制的研究多集中于相關信號通路方面［9-11］，然而關于柚皮苷和破骨細胞分化極化關系的研究并未見報道。本文旨在探究柚皮苷能否通過影響破骨細胞分化與極化進而影響破骨細胞的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料 柚皮苷購自美國Sigma 公司，小鼠單核細胞RAW264.7細胞株購自武漢普諾賽公司，高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco公司，重組小鼠可溶性核因子κB 受體活因子配體（sRANKL）、兔integrin β3 一抗購自美國Peprotech 公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自北京索萊寶公司，小鼠MMP-9 一抗購自美國R&D Systems公司，兔CK一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司，兔p-src 一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qPCR）引物購自武漢塞維爾公司，qPCR試劑盒購自北京Takara公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7 細胞系培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔1 d換液1次，細胞密度約為80%時傳代至6孔板。配置含10%FBS，100 μg/L sRANKL。對照組加入0 μg/L 柚皮苷培養(yǎng)液，實驗組分別加入2、20 和200 μg/L 柚皮苷培養(yǎng)液，每組3 個復孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.3 TRAP 染色 細胞培養(yǎng)7 d 后，棄掉培養(yǎng)液，PBS 沖洗3次，4%多聚甲醛固定60 s，PBS沖洗，使用TRAP染液于37 ℃下避光孵育1 h，PBS 沖洗后使用蘇木素復染30 s。4 組細胞均在100 倍視野下，隨機讀取10 個視野進行陽性細胞計數(shù)（陽性標準：細胞核≥3個且胞質(zhì)呈酒紅色）。

1.4 qPCR 檢測CK、MMP-9、integrin β3及c-srcmRNA 相對表達量 不同劑量柚皮苷干預細胞7 d，待細胞融合至90%時，依次使用Trizol、氯仿、乙醇及DEPC 水等抽提總RNA，操作均在冰上進行，根據(jù)試劑說明書進行RNA 的逆轉(zhuǎn)錄及cDNA 的擴增。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃15 min，85 ℃5 s。擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，目的基因相對表達量采用2-ΔΔCt法。引物序列見表1。

Tab.1 Amplification of gene primers by fluorescence quantitative PCR表1 qPCR擴增基因引物序列

1.5 蛋 白 免 疫 印跡（Western blot）法檢測CK、MMP-9、integrin β3 及p-src 蛋白相對表達量 不同劑量柚皮苷干預細胞7 d，待細胞融合至90%時，在孔板中加入含PMSF 的高效組織裂解液RIPA，冰上反復吹打，12 000×g離心10 min 后取上清。加入上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min 使蛋白變性，10%SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原1 h 后，稀釋一抗CK（1∶1 000）、MMP-9（1∶800）、integrin β3（1∶1 000）及p-src（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，隔天TBST洗膜3次，稀釋二抗，羊抗鼠二抗（1∶20 000）、羊抗兔二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學發(fā)光液顯影曝光。分析各組CK、MMP-9、integrin β3及p-src蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnet-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對破骨細胞計數(shù)結(jié)果的影響 對照組、2 μg/L 組、20 μg/L 組和200 μg/L 組陽性破骨細胞計數(shù)（個/100 倍視野）分別為29.50±2.22、23.20±1.81、20.10±0.88和16.20±1.03。與對照組相比，各實驗組TRAP 染色陽性細胞數(shù)均顯著降低（n=10，F(xiàn)=104.612，P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Effects of naringin on TRAP staining(left×100,right×200)圖1 柚皮苷對破骨細胞計數(shù)結(jié)果的影響（左×100，右×200）

2.2 柚皮苷對CK、MMP-9、integrin β3、c-srcmRNA表達水平的影響 與對照組比較，20 μg/L和200 μg/L 組CK、MMP-9、integrin β3mRNA 表達量顯著降低（P＜0.05），各實驗組c-srcmRNA 表達量顯著降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of naringin on mRNA expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and c-src表2 各組CK、MMP-9、integrin β3及c-src mRNA表達水平的比較（n=3，±s）

Tab.2 Effects of naringin on mRNA expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and c-src表2 各組CK、MMP-9、integrin β3及c-src mRNA表達水平的比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，a與對照組比較，b與2 μg/L組比較，c與20 μg/L組比較，P＜0.05；表3同

組別對照組2 μg/L組20 μg/L組200 μg/L組F CK 1.00±0.00 0.77±0.21 0.67±0.01a 0.44±0.10ab 11.607＊MMP-9 1.00±0.00 0.75±0.16 0.67±0.19a 0.60±0.18a 8.725＊intergrin β3 1.00±0.00 0.73±0.15 0.68±0.16a 0.49±0.08a 9.857＊c-src 1.00±0.00 0.75±0.06a 0.68±0.09a 0.39±0.09abc 37.453＊

2.3 柚皮苷對CK、MMP-9、integrin β3、p-src蛋白表達水平的影響 與對照組比較，20 μg/L組和200 μg/L 組CK 和p-src 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），各實驗組MMP-9和integrin β3蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表3。

Fig.2 Effects of naringin on protein expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and p-src圖2 各組CK、MMP-9、integrin β3及p-src蛋白相對表達量的比較

Tab.3 Effects of naringin on protein expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and p-src表3 各組CK、MMP-9、integrin β3及p-src蛋白相對表達水平的比較（n=3，±s）

Tab.3 Effects of naringin on protein expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and p-src表3 各組CK、MMP-9、integrin β3及p-src蛋白相對表達水平的比較（n=3，±s）

組別對照組2 μg/L組20 μg/L組200 μg/L組F CK 1.00±0.00 0.86±0.10 0.59±0.06ab 0.55±0.10ab 21.467＊MMP-9 1.00±0.00 0.73±0.06a 0.56±0.04ab 0.50±0.05ab 72.850＊integrin β3 1.00±0.00 0.53±0.04a 0.51±0.06a 0.49±0.04a 121.361＊p-src 1.00±0.00 0.83±0.14 0.49±0.14ab 0.36±0.08ab 22.341＊

3 討論

骨是一種礦化的結(jié)締組織，破骨細胞和成骨細胞之間的信號傳導對于骨重塑和骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義［12］。破骨細胞通過空泡腺苷三磷酸（ATP）酶、補體3a、軸突導向因子4D及微小RNA等影響成骨細胞骨形成；成骨細胞通過骨保護素/核因子受體活化因子/核因子受體活化因子配體（OPG/RANK/RANKL）、核因子受體活化因子配體/G 蛋白偶聯(lián)受體4/核因子受體活化因子（RANKL/LGR4/RANK）、促紅細胞生成肝細胞激酶受體相互作用蛋白B2/促紅細胞生成肝細胞激酶B4（EphrinB2/ephB4）和死亡受體/死亡配體（Fas/Fasl）等通路影響破骨細胞分化與凋亡［13］。破骨細胞特有的超微結(jié)構是完成其骨吸收功能的結(jié)構基礎，通過重組細胞骨架形成極化構象，將細胞表面膜分為4個區(qū)域，即封閉區(qū)、褶皺緣、基底外側(cè)區(qū)和功能分泌區(qū)［14］。極化的破骨細胞通過足質(zhì)體黏附于骨表面，肌動蛋白環(huán)圍繞褶皺緣形成相對獨立的微環(huán)境，通過釋放CK 和MMP-9 等水解酶實現(xiàn)骨吸收［15-16］。

柚皮苷又稱柚柑、異橙皮苷，是中藥骨碎補的重要成分。其化學本質(zhì)是一種雙氫黃酮類單體，分子式為C27H32O14，部分空間結(jié)構與雌激素類似，具有抗炎、抗氧化及改善微循環(huán)等功效。本研究中TRAP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組中陽性細胞數(shù)顯著降低，提示柚皮苷對破骨細胞的分化具有一定的抑制作用。qPCR 與Western blot 結(jié)果提示柚皮苷可以抑制CK與MMP-9 在破骨細胞中的表達?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種組織蛋白酶與破骨細胞功能相關，包括組織蛋白酶BE及組織蛋白酶G等，但是CK是骨吸收區(qū)酸性環(huán)境下發(fā)揮骨吸收作用的主要蛋白酶。同時，臨床研究發(fā)現(xiàn)CK抑制劑可以有效降低骨吸收指標，提高患者骨密度［3］。MMP-9 是一種鋅依賴蛋白水解酶，在哺乳動物胚胎期軟骨內(nèi)成骨及骨重建過程中起到膠原酶的作用，在細胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用，是破骨細胞和血管內(nèi)皮細胞侵入礦化組織所必須的生物因子，破骨細胞分化過程中，MMP-9表達上調(diào)，加速骨吸收［17］。Kim 等［18］在斑馬魚骨質(zhì)疏松模型中發(fā)現(xiàn)，抑制MMP-9可以增加鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色程度及椎體骨密度，改善骨質(zhì)疏松程度。

目前許多研究證明柚皮苷可以抑制破骨細胞功能。Ang 等［19］發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以抑制RANKL 介導的核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路，干擾破骨細胞的形成和功能。Li 等［20］證實柚皮苷通過下調(diào)抗凋亡蛋白B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2），上調(diào)促凋亡蛋白Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）及細胞色素C促進破骨細胞凋亡。Yu等［21］通過對骨吸收陷窩面積定量分析，發(fā)現(xiàn)柚皮苷對骨吸收有明顯抑制作用。目前研究大多聚焦于柚皮苷對信號通路的影響，然而破骨細胞的極化是其發(fā)揮骨吸收功能的重要生理過程。本研究重點探討柚皮苷對破骨細胞黏附與極化功能影響，發(fā)現(xiàn)2 μg/L 組和20 μg/L 組integrin β3與src的表達降低，提示柚皮苷可以抑制破骨細胞黏附和極化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，integrin β3 和src 在破骨細胞黏附和極化過程中發(fā)揮著重要作用，integrin與含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的蛋白（RGD）結(jié)合是破骨細胞極化的先決條件［22］。Mo等［23］在研究牙齦炎時發(fā)現(xiàn)，牙齦炎導致integrin β3表達上升，增強破骨細胞骨吸收功能，使用integrin β3特異性拮抗劑西侖吉肽后，破骨細胞功能受到抑制。基于蛋白芯片技術研制的新型蛋白質(zhì)抑制劑IPS-02001 可以抑制integrin 與骨橋蛋白結(jié)合，其抗骨質(zhì)疏松作用已經(jīng)在動物實驗中得到驗證，目前美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）尚未批準integrin 拮抗劑類藥物上市，但臨床前評估已經(jīng)取得了令人滿意的結(jié)果［24］。1991年Soriano等［25］首次發(fā)現(xiàn)c-src缺失會導致破骨細胞功能不全。c-src 與integrin 在骨吸收過程中是相互偶聯(lián)的。integrin αvβ3是integrin的一種異二聚體，脾酪氨酸激酶（Syk）是一種調(diào)節(jié)破骨細胞功能的酪氨酸激酶，位于免疫調(diào)節(jié)蛋白Dap12 和 免 疫 球 蛋 白FcRγ 下 游，細 胞 內(nèi)c-src、integrin αvβ3及Syk形成三元復合物，通過自身磷酸化激活鳥嘌呤核苷酸交換因子（Vas3），將小G 蛋白超家族（Rho）蛋白轉(zhuǎn)化成結(jié)合鳥苷三磷酸（GTP）的激活態(tài)，在肌動蛋白相關蛋白2/3（Arp2/3）復合體作用下形成肌動蛋白環(huán)，在突觸結(jié)合蛋白Ⅶ協(xié)同下，肌動蛋白環(huán)收縮形成褶皺緣，完成細胞極化［15，26-27］。本研究初步發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以在一定程度上抑制破骨細胞分化，降低CK、MMP-9、integrin β3、c-src 及psrc的表達，提示抑制破骨細胞分化與極化可能是柚皮苷抗OP 的機制之一。本研究的不足之處是僅觀察了基因與蛋白水平的變化，尚未進行上游信號通路方面的深入研究。另外，本研究目的重點是分析干預的有效性，實驗分組尚未篩選出抑制效果最顯著的藥物劑量，有待于后續(xù)研究進一步探討。