張楊蕊 龐 霞 黃 培 薛金慧

乳腺癌(breast cancer，BC)是多發(fā)病于女性的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈增長趨勢[1]。目前乳腺癌的主要治療方法為外科手術，但是術后腫瘤轉移、腫瘤耐藥、預后差等問題仍然是乳腺癌治療的難題[2]。已有研究表明[3]，特異性的分子靶向治療能夠有效提高惡性腫瘤治療效果以及改善患者預后，但是對于乳腺癌的分子靶向治療的研究尚不全面。

MicroRNA(miRNA)是一類長度為21～23個核苷酸的小RNA，成熟的miRNA可被整合到RNA誘導的沉默復合物中，并且以不完全互補的方式與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)中的特定位點結合，以介導RNA的降解或抑制RNA的蛋白質的翻譯[4]。已有研究表明，miRNA在腫瘤組織中差異表達，介導腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如，在腎細胞癌中，miR-425-5p的表達上調并促進腫瘤細胞活力、侵襲和遷移[5]；在前列腺癌中，高miR-425-5p表達可顯著促進腫瘤細胞增殖，遷移和侵襲[6]。但是，miR-425-5p在乳腺癌中的作用仍然未知。本研究探究了miR-425-5p對乳腺癌細胞的作用，旨在為乳腺癌的分子治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺上皮細胞MCF10A(中國科學院上海生命科學研究所)；乳腺癌細胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20(中國科學院上海生命科學研究所)；miR-425-5p mimic、miR-425-5p mimic NC、miR-425-5p inhibitor、miR-425-5p inhibitor NC(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；RNA轉染試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；PTEN小干擾RNA(siPTEN)(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；PTEN質粒(漢恒生物技術有限公司)；MTT檢測試劑盒、細胞凋亡試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)；PTEN抗體、山羊抗兔二抗(沈陽萬類生物技術有限公司)，RT-qPCR檢測試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取液氮保存的MCF10A、MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20細胞，于37 ℃水浴鍋中快速解凍，加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基稀釋，1 000 rpm離心5 min，然后將細胞重懸，轉移至培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞匯合率達80%時進行傳代。

1.2.2 RT-qPCR檢測乳腺癌細胞中miR-425-5p的表達水平 取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞和乳腺上皮細胞至離心管中，加入Trizol裂解5 min，將200 μl氯仿加入上述裂解液，靜置5 min，12000×g，4 ℃離心15 min，取上層溶液，加入500 μl異丙醇，12000×g，4 ℃離心10 min，棄上清，1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μl RNA-free水重懸RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即為總RNA，使用核酸定量儀檢測總RNA含量。根據(jù)miRNA cDNA Synthesis 試劑盒指示配置反應體系，將提取的RNA逆轉為cDNA，然后利用核酸定量儀對cDNA進行定量。然后根據(jù)EvaGreen miRNA qPCR試劑盒指示配置反應體系，進行qPCR反應，采用GAPDH作為內參，反應后采用2-ΔΔCt法計算miR-425-5p的表達量。

1.2.3 細胞轉染 取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞接種于6孔板中，按照RNA轉染試劑盒說明書，取3 μg的RNA用不含血清及雙抗的DMEM稀釋至100 μl，然后加入5 μl的RNA轉染試劑，靜置20 min后，稀釋至1 ml，并用上述混合液培養(yǎng)乳腺癌細胞8 h，然后更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。根據(jù)脂質體2000轉染試劑說明書，將對數(shù)生長期的乳腺癌細胞接種至6孔板中，細胞生長至70%時，按說明書進行轉染PTEN質粒。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖 將乳腺癌細胞調整至50000個/ml，將上述細胞接種至96孔板，每孔100 μl，每組3個復孔，并將細胞培養(yǎng)2～4 h，使乳腺癌細胞完全貼壁，然后每孔加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度，OD值越大，細胞增殖能力越強。

1.2.5 Transwell小室法檢測細胞遷移 調整細胞至5×104個/ml，并取200 μl細胞接種至Transwell小室中，每組3個復孔，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl完全培養(yǎng)基，使小室底部浸入培養(yǎng)基，將24孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室用PBS清洗，小室底部用無水乙醇固定30 min，晾干后用結晶紫對小室底部染色10 min，清洗晾干后，在顯微鏡下觀察拍照，每孔拍5張照片，并用Photoshop軟件計數(shù)，比較各組遷移的細胞數(shù)目，細胞數(shù)目越多，細胞遷移能力越強。

1.2.6 熒光素酶報告實驗驗證靶基因 使用miRDB和microT-CD 2個數(shù)據(jù)庫篩選miR-425-5p的靶基因，取2個數(shù)據(jù)庫中的靶基因的交集，并使用Targetscan軟件根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的信息對靶基因進行置信水平分析，取置信水平最高的靶基因。構建GLS1野生型(pGL3-PTEN WT組)、突變型質粒(pGL3-PTEN MUT組)以及空白質粒(pGL3-control組)，并使用脂質體2000轉染試劑將上述質粒轉染進293T細胞，再用RNA轉染試劑將miR-425-5p mimic和miR-425-5p mimic NC轉染至上述293T細胞，按照雙熒光素酶報告實驗檢測試劑盒檢測熒光素酶反應強度。

1.2.7 Western blot檢測乳腺癌細胞中PTEN表達水平 取各組細胞加入125 μl的RIPA蛋白裂解液和5 μl的PMSF蛋白酶抑制劑，裂解30 min后，12000×r，4 ℃離心10 min，取上清，即為總蛋白。BCA蛋白定量后蛋白沸水浴加熱變性，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的脫脂牛奶對PVDF膜封閉2 h，然后以1∶1000比例稀釋后的PTEN、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育12 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應30 s，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MiR-425-5p在乳腺癌細胞株中的表達情況

RT-qPCR檢測結果顯示，乳腺癌細胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20中miR-425-5p表達水平均顯著高于乳腺上皮細胞MCF10A(P<0.05)，見圖1；提示乳腺癌細胞通過高表達miR-425-5p促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

注：與MCF10A相比，*P<0.05；*** P<0.001。

2.2 MiR-425-5p對乳腺癌細胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結果(圖2)顯示，相比于轉染MiR-NC組，轉染miR-425-5p mimic組的MCF-7細胞增殖能力顯著增加(P<0.05)，而轉染miR-425-5p inhibitor組的MDA-MB-231細胞增殖能力顯著下降，提示過表達miR-425-5p可促進乳腺癌增殖能力。

2.3 MiR-425-5p對乳腺癌細胞遷移能力的影響

細胞遷移檢測結果(圖3)顯示，相比于miR-NC組，轉染miR-425-5p mimic組的MCF-7細胞遷移能力顯著增加(P<0.001)，而轉染miR-425-5p inhibitor組的MDA-MB-231細胞遷移能力顯著下降，說明miR-425-5p能夠顯著促進乳腺癌細胞的遷移能力。

2.4 MiR-425-5p能夠靶向結合PTEN

數(shù)據(jù)庫篩選結果顯示PTEN為miR-425-5p的靶基因，其靶向結合位點如圖4所示。雙熒光素酶實驗驗證PTEN與miR-425-5p靶向關系結果顯示(圖5)，miR-425-5p mimic能夠使pGL3-PTEN WT組細胞熒光強度顯著下降(P<0.001)，而pGL3-Control組和pGL3-PTEN MUT組細胞熒光強度無顯著變化，說明PTEN為miR-425-5p的靶基因。

2.5 MiR-425-5p對PTEN蛋白水平表達的影響

Western blot檢測結果(圖6)顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細胞中，轉染miR-425-5p mimic后PTEN表達顯著下調(P<0.001)，轉染miR-425-5p inhibitor后PTEN表達顯著上調(P<0.001)，說明miR-425-5p可抑制抑癌基因PTEN的表達，進而影響了乳腺癌細胞的生長和轉移。

2.6 MiR-425-5p靶向PTEN促進乳腺癌細胞增殖能力

CCK-8檢測結果(圖7)顯示，miR-425-5p mimic能夠顯著促進MCF-7增殖能力(P<0.01)，而轉染PTEN過表達質粒后其增殖能力顯著低于miR-425-5p mimic組(P<0.05)，與對照組無顯著性差異(P>0.05)；miR-425-5p inhibitor能夠顯著抑制MDA-MB-231增殖能力(P<0.01)，而轉染siPTEN抑制PTEN表達后細胞增殖能力顯著增加(P<0.05)，提示miR-425-5p能夠抑制PTEN的表達而提高乳腺癌細胞的增殖能力。

2.7 MiR-425-5p靶向PTEN促進乳腺癌細胞遷移能力

細胞遷移實驗檢測結果(圖8)顯示，miR-425-5p mimic顯著促進MCF-7遷移(P<0.001)，過表達PTEN后MCF-7遷移能力顯著下調(P<0.001)；轉染miR-425-5p inhibitor顯著抑制MDA-MB-231遷移能力(P<0.01)，而抑制PTEN表達后細胞遷移顯著增加(P<0.05)，提示miR-425-5p能夠抑制PTEN的表達而促進乳腺癌細胞的體外轉移能力。

注：與MiR-NC相比，*P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001。

注：與MiR-NC相比，*** P<0.001。

圖4 miR-425-5p與PTEN結合區(qū)域預測結果及結合區(qū)域突變結果

注：與miR-NC組相比，***表示P<0.001。

注：與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

根據(jù)2015年國家癌癥中心統(tǒng)計結果，我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，且逐漸趨于年輕化，國家癌癥研究機構預計，截至2030年，乳腺癌的死亡率將上升至47.94%[7-8]。已有研究表明，術后復發(fā)、腫瘤轉移、腫瘤耐藥等均是導致乳腺癌高死亡率的原因，因此探究乳腺癌生長和轉移的機制對于乳腺癌的臨床治療至關重要。

隨著精準醫(yī)療和分子診斷的發(fā)展，越來越多的研究將腫瘤的治療集中在基因水平，其中miRNA在調控腫瘤生長和轉移的過程中發(fā)揮重要的作用，研究表明人類基因組中約有三分之一的基因受miRNA的調控，其作用機制主要是通過結合mRNA3'-UTR而抑制靶基因的表達，在基因的表達中起到負調控的作用，腫瘤組織miRNA的差異表達是調控腫瘤增殖、遷移、凋亡等生物學進程的重要因素[9-10]，例如[11]，miR-1299在三陰性乳腺癌中高表達而促進腫瘤的增殖和遷移能力，miRNA-621調控乳腺癌的化療耐藥，而本研究發(fā)現(xiàn)miR-425-5p在5種乳腺癌細胞中均高表達，提示miR-425-5p作為差異表達的miRNA或可影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

注：與NC相比，** P<0.01；*** P<0.001；與miR-425-5p mimic組相比，# P<0.05，### P<0.001；與miR-425-5p inhibitor組相比，a P<0.05，aaP<0.001。

注：與NC相比，*** P<0.001；與miR-425-5p mimic組相比，### P<0.001；與miR-425-5p inhibitor組相比，aaaP<0.001。

本研究發(fā)現(xiàn)，在miR-425-5p表達量較低的乳腺癌細胞株MCF-7中，轉染miR-425-5p mimic 過表達miR-425-5p后MCF-7的增殖能力和遷移能力顯著增加；而在miR-425-5p表達較高的MDA-MB-231細胞中轉染miR-425-5p inhibitor抑制miR-425-5p表達后MDA-MB-231的增殖能力和遷移能力顯著降低，說明miR-425-5p對乳腺癌的生長和轉移均有顯著影響，或可作為乳腺癌治療或診斷的生物標志物。

PTEN是抑癌基因家族中的一員，具有磷酸酯酶的活性，PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。研究表明，將野生型PTEN基因轉染到該基因異常的膠質母細胞瘤后，腫瘤細胞的生長、侵襲能力受到明顯抑制，發(fā)現(xiàn)其對腫瘤細胞的酪氨酸激酶FAK的活性有明顯的抑制作用。此外，PTEN蛋白還可通過特異性地使IP3的第三位磷酸去磷酸化而間接地抑制胰島素誘導的磷酸肌醇-3激酶的活性，進而調控細胞的生長[13-14]。

本研究通過數(shù)據(jù)可預測到PTEN可能為miR-425-5p的靶基因，并通過雙熒光素酶報告實驗驗證了PTEN和miR-425-5p的靶向關系，并且發(fā)現(xiàn)轉染miR-425-5p mimic的乳腺癌細胞PTEN表達顯著下調，而轉染miR-425-5p inhibitor的乳腺癌細胞PTEN表達顯著上調，而已有研究表明PTEN可調控腫瘤的生長和轉移，所以提示miR-425-5p或可通過抑制PTEN的表達而調控乳腺癌的生長和轉移，實驗結果表明，在MCF-7中轉染質粒過表達PTEN后，miR-425-5p mimic的促增殖和遷移作用則被逆轉；MDA-MB-231中抑制PTEN表達后，miR-425-5p inhibitor的抑制增殖和遷移作用亦被逆轉，說明PTEN作為miR-425-5p的下游靶基因調控乳腺癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-425-5p能夠調控乳腺癌細胞的體外生長和轉移，其機制可能為抑制抑癌基因PTEN的表達。