陶麗娟，李建濤，楊桂芹

（沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866）

近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展和養(yǎng)殖水平的改善，飼料工業(yè)也實現(xiàn)了較快發(fā)展和技術(shù)進步。但抗生素使動物體產(chǎn)生耐藥性，給食品衛(wèi)生與安全帶來隱患。微生物發(fā)酵作為飼料端和養(yǎng)殖端減抗禁抗的替代技術(shù)，正引起行業(yè)越來越多的關(guān)注，這為飼料業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中微生物發(fā)酵飼料的研發(fā)和應(yīng)用提供了龐大的空間。微生物發(fā)酵飼料是指以飼料和飼料添加劑為對象，以基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程和生物提取等高新技術(shù)為手段，利用微生物發(fā)酵工程開發(fā)的新型飼料和飼料添加劑的總稱。其優(yōu)點在于通過微生物的發(fā)酵作用，降低了抗營養(yǎng)因子含量（王永偉等，2019），使飼料原料的理化性狀得到改善，從而提高動物的消化利用率和適口性。胡宏偉等（2018）指出，飼料經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后會產(chǎn)生大量乳酸，其適口性及飼料消化率明顯提高。同時飼料發(fā)酵過后會產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，提高有益菌的含量，抑制或殺死致病菌。Van等（2001）試驗表明，飼喂發(fā)酵飼料的豬胃和回腸中的乳酸菌含量均顯著高于飼喂干飼料的豬。本文綜述了微生物發(fā)酵飼料的菌種及特征、生產(chǎn)工藝、代謝產(chǎn)物檢測及其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀及存在的問題，并對其應(yīng)用前景進行了展望，以期為微生物發(fā)酵飼料的推廣應(yīng)用提供參考。

1 發(fā)酵菌種

微生物發(fā)酵飼料的核心是發(fā)酵菌種的篩選。當前用于發(fā)酵飼料最常見的菌種主要是乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等。其選擇原則是不能破壞體內(nèi)菌群平衡，不能產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素等，以保證畜產(chǎn)品安全（陶蕾等，2015）。

1.1 乳酸菌 乳酸菌是指可以利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的通稱，是一種安全、優(yōu)質(zhì)、高效的益生菌，耐酸能力比較強（Wu等，2014）。目前有11種乳酸菌可作為添加劑直接飼喂動物，分為九個屬。乳酸菌進入腸道后會產(chǎn)生多種益生成分和抑菌物質(zhì)，能夠殺死或抑制病原微生物，從而提高機體免疫力和抵抗力 （計偉等，2018；Wang 等，2014），使畜禽生產(chǎn)性能得以提升。Awais等（2019）研究指出，飼喂以乳酸菌為主的益生菌能提高淋巴細胞增殖反應(yīng)，與對照組相比，使用益生菌治療的試驗雞有更高的抗體滴度，益生菌治療組的雞飼料轉(zhuǎn)化率也得到顯著改善。乳酸菌發(fā)酵飼料是指將飼料調(diào)配水分、養(yǎng)分及接種乳酸菌后，通過發(fā)酵的作用，形成營養(yǎng)豐富、適口性優(yōu)良、含有大量益生菌及有益代謝產(chǎn)物的功能性飼料。乳酸菌發(fā)酵飼料可以提高經(jīng)濟效益（朱鳳華等，2015）、提高生長性能（徐秀景等，2018）、改善動物體的健康狀態(tài)（張錚等，2018）、提高飼料品質(zhì)（韓雅慧等，2016）。 因此乳酸菌發(fā)酵已成為國內(nèi)外的研究熱點，并且在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。

1.2 酵母菌 酵母屬于兼性菌，在自然界中分布廣泛，飼料酵母含有較高的粗蛋白質(zhì)、氨基酸及多種維生素，同時含有動物所需的多種消化酶（淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等），對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用有重要作用（Pacheco等，1998）。酵母菌是畜禽動物的優(yōu)勢菌群，可以刺激其腸道中有益菌含量的增加（Ding等，2014），還可以直接和腸道中的病原體結(jié)合，中和胃腸中的毒素（馬傳興等，2014）。同時酵母菌具有濃烈的酵母香味，對促進畜禽采食有一定作用。張政（2017）研究表明，活性酵母可使發(fā)酵液中的菌體蛋白和揮發(fā)性脂肪酸的含量得到顯著提高，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率。李璐琳等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，矮腳黃肉雞在14日齡起飲用以酵母菌為主要成分的發(fā)酵菌液能顯著降低14～78日齡的料重比，提高養(yǎng)殖效率。雖然酵母菌是一種很好的單細胞蛋白飼料添加劑，但在實際應(yīng)用時因其氨基酸含量平衡不理想，且酵母菌適口性不佳，因此，應(yīng)按照實際情況來確定添加量。

1.3 芽孢桿菌 芽孢桿菌是一類安全無毒的益生菌，可以改善腸道微生態(tài)環(huán)境、提高機體免疫力、促進動物消化吸收和營養(yǎng)代謝（Zhao，2011）。芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿、耐高壓等特點（張愛武等，2011），能夠降低顆粒飼料加工的影響。在儲藏過程中以孢子形式存在，不消耗飼料的營養(yǎng)成分，保持飼料的質(zhì)量。王曉丹等（2019）將枯草芽孢桿菌添加到日糧中發(fā)現(xiàn)，其可以降低仔豬腹瀉率，促進仔豬生長。胡振華等（2018）將枯草芽孢桿菌添加到櫻桃谷肉鴨飼糧中發(fā)現(xiàn)，其可以改善腸道形態(tài)，增加腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量以及刺激免疫器官的發(fā)育，促進肉鴨生長。同時芽孢桿菌與酵母菌能夠迅速消耗發(fā)酵底物中的氧氣，為乳酸菌的生長繁殖提供厭氧環(huán)境，促進乳酸菌的繁殖生長（楊軍等，2017）。

2 生產(chǎn)工藝

微生物發(fā)酵飼料生產(chǎn)主要包括兩個階段，即微生物菌種和微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)，選擇合適的菌種再加上適當?shù)陌l(fā)酵條件和生產(chǎn)工藝才能得到高品質(zhì)的發(fā)酵飼料（韓淑敏等，2018）。目前有關(guān)微生物發(fā)酵工藝參數(shù)的研究報道雖然較多，但是對于菌種資源和發(fā)酵工藝依然有嚴格的衡量標準，影響發(fā)酵飼料品質(zhì)的主要因素有菌種的配比、含水量、發(fā)酵時間、溫度等。其中含水量是關(guān)鍵因素，含水量過低會降低物料的膨脹程度、提高水的表面張力、殘留過多空氣，從而延長前期好氧階段，乳酸菌發(fā)酵階段延后，無法控制發(fā)酵結(jié)束時間。含水量過高會限制氧氣擴散，無法積累足夠的酵母菌等好氧菌的代謝產(chǎn)物，并且增加物料黏性，使流散性變差，在后期飼喂時難以混勻。楊建平等（2017）通過試驗確定了簡易發(fā)酵飼料在發(fā)酵溫度為30℃，含水量40%，發(fā)酵7 d后以3%代替全價飼料飼喂育肥豬，豬的采食量和日增重均顯著升高，料肉比顯著降低。吝長華等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌單菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件為接種量10%、溫度40℃、料水比1.0：1.2、發(fā)酵時間72 h。微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝是該領(lǐng)域的研究熱點之一，在原料處理、生產(chǎn)設(shè)備優(yōu)化升級、產(chǎn)品儲存及檢測等方面仍需要更多的應(yīng)用研究。

3 發(fā)酵產(chǎn)物及檢測

發(fā)酵飼料中常見的代謝產(chǎn)物包括有機酸、維生素、酶、氨基酸、脂肪酸和抑菌物質(zhì)等。了解各種菌的代謝產(chǎn)物可以幫助我們更好地了解發(fā)酵飼料的功能。

3.1 乳酸菌 乳酸菌發(fā)酵飼料會產(chǎn)生大量有機酸（乳酸、乙酸、丙酸等）、細菌素、胞外多糖等代謝產(chǎn)物，并且會產(chǎn)生大量乳酸菌。

目前研究中細菌數(shù)的測定方法大多為平板菌落計數(shù)法（Goidstein 等，2014）。 Lamba 等（2019）、任燕（2018）及塔娜等（2017）均采用此法測定細菌數(shù)量，但在培養(yǎng)結(jié)束后，菌落的計數(shù)并不容易。林鐵豪等（2018）、譚薇等（2015）、李可等（2015）則采用熒光定量PCR法對細菌數(shù)進行定量分析。目前欠缺可供飼料生產(chǎn)領(lǐng)域使用的快速高效的菌群檢測技術(shù)。采用高效液相色譜法（HPLC）及離子色譜法測定有機酸，酸堿滴定法測定總酸含量，其中HPLC（Coelho 等，2018；Zaky 等，2017）應(yīng)用比較廣泛。羅建等（2012）在對乳酸含量的測定研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶的準確性最好，迅速但成本高；EDTA滴鈣法適合于迅速簡便、精度要求不高的檢測；羥基聯(lián)苯比色法可作為企業(yè)或科研單位精度要求不高的檢測。

細菌素是一類在細菌代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的具有抑菌活性的小分子物質(zhì)，其相對分子質(zhì)量小且熱穩(wěn)定性好，具有殺菌作用（Woraprayote 等，2016；朱雙等，2014）。 評價抑菌活性物質(zhì)的方法主要有瓊脂平板擴散法 （Jacobson等，2019）和96孔板微量測定法 （侯媛媛，2015），瓊脂擴散法包括點種法、紙片法和牛津杯法，其中牛津杯法最簡單及常用。但是，當抑菌圈超過25 mm以上，這個方法便不夠準確，需要再次稀釋。96孔板微量測定法則靈敏度高、耗材少，適合批量試驗。胞外多糖是一類糖類化合物，其結(jié)構(gòu)復雜、且有多種益生功能（杜瑞平等，2018）?？赏ㄟ^苯酚-硫酸法（高倩等，2019）測定其含量。乳酸菌在發(fā)酵過程中還能夠產(chǎn)生其他更多有益的代謝產(chǎn)物，對于其作用還有待進一步研究。

3.2 酵母菌 酵母菌發(fā)酵可以產(chǎn)生多種化合物，包括各種高級醇、酚類化合物、羰基化合物、脂肪衍生物和硫化合物，這些化合物具有揮發(fā)性（Dzialo等，2017）。在無氧條件下進行厭氧發(fā)酵，會產(chǎn)生乙醇、揮發(fā)性脂肪酸等物質(zhì) （Rezaei等，2016）。董琪等（2018）采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對發(fā)酵產(chǎn)物進行分析。趙軍（2011）采用平板計數(shù)法測定酵母數(shù)量，采用氣相色譜法對酒精以及乙酸乙酯進行測定，葡萄糖的測定則采用了3，5-二硝基水楊酸酸法，揮發(fā)酸度采用EEC標準方法。

3.3 芽孢桿菌 芽孢桿菌發(fā)酵飼料會產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶以及維生素等有益代謝產(chǎn)物，可促進生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率。徐海燕等（2006）在對芽孢桿菌代謝產(chǎn)物進行研究時采用細菌α-淀粉酶活力測定的方法測定淀粉酶活性，采用福林-酚法測定蛋白酶活性，脂肪酶活力用標準堿液滴定的脂肪酸的滴定值表示，利用氣相色譜儀檢測揮發(fā)性脂肪酸；樣品經(jīng)離心后取上清液，并提供了淀粉酶活力測定方法（曾亞桐，2018）。

乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌均能產(chǎn)生多種維生素，但不同菌種產(chǎn)生的維生素種類不同，量也有差異，因此對于維生素的檢測比較困難，在檢測時會遇到某些維生素檢測不到、而有些維生素含量很高的情況。目前可以采用將發(fā)酵前后的維生素含量做對照，以此分析微生物發(fā)酵對飼料中維生素含量的影響。對于氨基酸含量變化也可采用此法。

4 微生物發(fā)酵飼料在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1 家禽 在雞的飼養(yǎng)過程中加入一定量的微生物發(fā)酵飼料，可以改善雞蛋的品質(zhì)，提高產(chǎn)蛋和產(chǎn)肉的效率；提高雞的生產(chǎn)性能，促進生長，改善腸道菌群，提高免疫力等。趙玉娥（2018）研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵飼料可以明顯改善蛋雞的腸道微生態(tài)平衡，降低氮、磷排泄率，在每日100 kg常規(guī)基礎(chǔ)日糧中加10 kg的效果較好。趙春全（2014）將不同比例的發(fā)酵飼料添加到蛋雞的日糧中發(fā)現(xiàn)，雞蛋的蛋品質(zhì)得到不同程度的改善，其中5%的添加量可以獲得較好的生產(chǎn)性能。閆理東等（2012）將發(fā)酵棉籽粕按不同比例添加到黃羽肉雞飼料中發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加3%、6%的發(fā)酵棉籽粕，與不發(fā)酵相比能顯著提高黃羽肉雞的平均日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，其中以6%發(fā)酵棉籽粕為宜。Kim等（2016）研究表明，發(fā)酵豆粕可以改善肉雞的腸道菌群環(huán)境，提高其免疫功能，從而達到促進肉雞生長的作用。

4.2 豬 研究表明，微生物發(fā)酵飼料可以改善豬的生長性能、繁殖性能以及腸道功能。周學海（2018）將微生物發(fā)酵飼料添加到配合飼料中發(fā)現(xiàn)，育肥豬日采食量和日增重提高，其中以30%添加量為最佳。張錚等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，飼喂復合菌發(fā)酵飼料可在一定程度上影響育肥豬結(jié)腸中細菌菌群的組成，促進丁酸生成，對腸道健康具有改善作用。林標聲等（2016）將4%的微生物發(fā)酵飼料添加到生豬常規(guī)飼糧中，飼養(yǎng)106 d后屠宰發(fā)現(xiàn)，育肥豬的屠宰性能及肉品質(zhì)、脂肪酸和氨基酸含量均明顯優(yōu)于對照組，明顯改善了豬肉的風味。石青松等（2018）將添加了20%乳酸菌發(fā)酵飼料的配合飼料飼喂斷奶仔豬，結(jié)果表明，仔豬的平均日采食量顯著提高，仔豬胃、回腸及結(jié)腸食糜的pH顯著降低，結(jié)腸中乙酸含量和糞便中的乳酸菌數(shù)量顯著提高，大腸桿菌數(shù)量顯著降低，斷奶仔豬腸道微生物得到明顯改善。丁鵬等（2018）研究發(fā)現(xiàn)飼料桑粉經(jīng)發(fā)酵后飼喂寧鄉(xiāng)花豬可降低平均背膘厚，改善肉品質(zhì)，降低血清總膽固醇含量；添加9%飼料桑粉的發(fā)酵料可降低料重比，改善寧鄉(xiāng)花豬的生長性能。周映華等（2015）研究表明，食用無抗發(fā)酵飼料的育肥豬，其生長性能和腸道微生物菌群平衡得到明顯改善，消化能力得以增強。

4.3 反芻動物 微生物發(fā)酵飼料不但在禽類和豬的生產(chǎn)上有較多的應(yīng)用，在反芻動物飼養(yǎng)中也得到了普遍認可。嚴昌國等（2005）報道，飼喂發(fā)酵飼料的延邊黃牛日增重為0.98 kg，對照組為0.77 kg，差異極顯著。盧慧（2017）在研究微生物發(fā)酵飼料對奶牛生產(chǎn)性能的影響時發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵飼料的添加可以顯著提升泌乳奶牛的產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)，同時可增強飼糧養(yǎng)分表觀消化率，進而提高養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益。這與梅寧安等（2015）和吳小燕等（2014）的研究結(jié)果一致。高旭紅等（2018）給山羊飼喂含30%發(fā)酵杏鮑菇菌糠的飼料后，山羊的平均日增重和體增重均高于飼喂未發(fā)酵杏鮑菇菌糠，料重比低于飼喂未發(fā)酵杏鮑菇菌糠。

5 微生物發(fā)酵飼料存在的問題及展望

5.1 問題 微生物發(fā)酵飼料將對我國畜牧業(yè)健康發(fā)展具有較大的促進作用，但尚需開展基礎(chǔ)性、應(yīng)用性研究和實踐驗證。由于篩選各種菌種的方向和方法不同，生產(chǎn)水平、飼料加工以及動物品種、儲存、飼喂條件等差異，微生物發(fā)酵飼料未能獲得穩(wěn)定、一致的飼喂效果。下一步需要在發(fā)酵微生物菌種、菌株的篩選，單一原料和混合飼料的發(fā)酵特征及發(fā)酵底物的營養(yǎng)完善，發(fā)酵飼料與常規(guī)飼料的搭配使用技術(shù)，發(fā)酵飼料營養(yǎng)價值庫的建立，發(fā)酵對飼料中礦物元素、維生素、氨基酸添加劑的效價影響，以及發(fā)酵工藝簡化和標準化等方面開展調(diào)查研究。微生物發(fā)酵會產(chǎn)生眾多代謝物質(zhì)，但迄今對其中有效成分缺乏全面系統(tǒng)研究，導致其品質(zhì)難以鑒定，需要盡快制訂和完善行業(yè)標準和檢測方法。同時，發(fā)酵飼料的加工、包裝以及儲存成本給其推廣應(yīng)用帶來較大障礙，選擇經(jīng)濟有效的防凍、防結(jié)塊、防霉變的儲存方法和技術(shù)，對于發(fā)酵飼料的推廣應(yīng)用有著重要經(jīng)濟意義。此外，還需要在微生物發(fā)酵飼料的生物安全性、畜產(chǎn)品安全優(yōu)質(zhì)上開展更多研究。

5.2 展望 微生物發(fā)酵飼料可以減少飼糧中的抗生素含量，提高飼料適口性，減少飼料中鐵、錳、鋅、鈣的添加量，提高利用率。微生物發(fā)酵后產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物 （有機酸、細菌素、核酸類物質(zhì)等），能有效抑制腸道有害菌的生長發(fā)育，提高動物機體免疫力。同時通過各種動物飼養(yǎng)試驗以及消化代謝試驗，評價發(fā)酵技術(shù)的性價比，優(yōu)化烘干工藝及技術(shù)，解決發(fā)酵產(chǎn)品的包裝運輸成本是重中之重。隨著社會對養(yǎng)殖業(yè)環(huán)保問題的持續(xù)關(guān)注，人們對畜產(chǎn)品品質(zhì)的愈加重視以及微生物發(fā)酵技術(shù)不斷進步，微生物發(fā)酵飼料在畜禽生產(chǎn)中必將獲得更加廣泛的應(yīng)用。