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        葛花異黃酮檢驗(yàn)方法研究

        2020-12-17 12:43:47
        農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備 2020年11期
        關(guān)鍵詞:葛花鳶尾異黃酮

        宋 笛

        (長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130033)

        1 葛花的藥用價(jià)值

        葛花,中藥名又稱(chēng)葛根花, 屬豆科植物野葛Pueraria lobate(Willd.)Ohwi,也可將其視為甘葛藤Pueraria thomsonii Benth的干燥[1]花蕾。野葛除新疆、西藏外,廣泛分布于全國(guó)各地。甘葛藤則多分布于四川、云南、廣東、廣西等地,常生長(zhǎng)或被栽培于較陰濕的山坡草叢中或灌木叢中。野葛花花冠為藍(lán)紫色或紫色,甘葛藤的花又叫粉葛花,花冠呈紫色或灰紫色,久置過(guò)后變?yōu)辄S白色至深黃色。兩種花均無(wú)臭,味淡,可入藥或作為花草茶飲用。

        其功效大致有以下幾種:①解酒護(hù)肝。治療煩熱口渴,頭痛頭暈,飽脹嘔吐,反流酸水等傷酒之癥;②清熱解毒。治療感冒發(fā)熱、小兒腹瀉、急性胃腸炎、突發(fā)性耳聾等疾??;③調(diào)節(jié)內(nèi)分泌。葛花能調(diào)節(jié)人體機(jī)能,增強(qiáng)體質(zhì),提高機(jī)體抗病能力,抗衰延年;④其他功效。固齒強(qiáng)骨,預(yù)防蛀牙、增強(qiáng)兒童發(fā)育和智力。對(duì)緩解高血壓、冠心病、心絞痛有一定作用。

        葛花的這些營(yíng)養(yǎng)保健及藥用價(jià)值,歸功于其富含葛花素、大豆黃酮、花生素、多種氨基酸等成分。而且還含有豐富的銅、硒、鈣、鐵、銅、硒等礦物質(zhì)。作為一種藥食同源的植物,很早便在《神農(nóng)本草經(jīng)》《千金方》《本草綱目》中有所記載。

        2 葛花的研究現(xiàn)狀

        隨著葛根功效被熟知,許多專(zhuān)業(yè)從事葛根栽培和葛根產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的公司如雨后春筍般出現(xiàn)。粉用葛根的品種選育、種植基地、食品加工方面的進(jìn)步,帶動(dòng)了葛根及葛花的藥理研究、成分提取、新藥開(kāi)發(fā)。隨著葛花中越來(lái)越多的化學(xué)成分被檢出,其新的藥理活性領(lǐng)域也在不斷擴(kuò)大。根據(jù)現(xiàn)代研究結(jié)果可知,葛根內(nèi)部含有量最大的物質(zhì)為黃酮類(lèi)化合物,其余物質(zhì)包括揮發(fā)油、皂苷、甾醇、揮發(fā)油、氨基酸,其中黃酮類(lèi)化合物在葛根葛花中表現(xiàn)突出,如鳶尾苷(tectoridin)、尼泊爾鳶尾素(irisolidone)、鳶尾黃素(tectorigenin)、6'-O- 木 糖 鳶 尾 苷(6'-O-xylo -syl -tectoridin);刺槐素(robinin)、芒柄花素(formomonetin)、染料木素(genistein)、黃豆黃素(glycitein)、大豆黃素(daidzein)、槲皮素(quercetin);葛花亭(kakkatin)、蘆丁(rutin)、葛花苷(kakkalide)、鷹嘴豆素甲(biocanin A)、芒柄花苷(ononin)、煙花苷(nicotiflorin)、黃豆黃苷(glycitin)、6'-O- 木糖黃豆苷(6'-O-xylosy -glycitin)[2]。

        其中,葛花苷和鳶尾苷在葛花中的含量較高,是葛花異黃酮的代表性成分[3]。張淑萍等[4]采用反相高效液相色譜法測(cè)定了葛花中3 種異黃酮(葛花苷、次葛花苷和尼泊爾鳶尾異黃酮三種異黃酮)的含量,分別為3.33%、0.22%和0.32%。

        目前,葛花異黃酮的提取工藝常見(jiàn)于文獻(xiàn)的有色譜法、溶液法等。

        2.1 色譜法

        尹俊亭[5-6]在葛花提取物分離、純化、重結(jié)晶操作使用了硅膠柱色譜,分離結(jié)果可知,葛花可提取出尼泊爾鳶尾異黃酮7-O-β-D- 葡萄糖苷、染料木苷(genistin)等物質(zhì)。張淑萍等[7]使用色譜、光譜、理化相結(jié)合的方法對(duì)葛花進(jìn)行分離提取,得到了刺芒柄花素(formononetin)、尼泊爾鳶尾異黃酮、大豆苷元、8- C- 芹菜糖塘(1→6)- 葡萄糖- 大豆苷等物質(zhì)。裴香萍[8]是第一位使用聚酰胺柱色譜法提取出葛花醇提物內(nèi)7- 甲氧基香豆素的學(xué)者。張杰等[9]曾使用羥丙基葡聚糖凝膠及硅膠色譜柱方法對(duì)葛花進(jìn)行了分離提取,第一次從葛花中獲取了5,6,7,4'- 四羥基異黃酮- 6,7- 二葡萄糖苷物質(zhì)。

        2.2 溶液法

        葛花提取物提取最常用的溶劑為乙醇,在提取過(guò)程中浸提時(shí)間、浸提溫度、固液比、乙醇濃度、回流時(shí)間等因素[10]對(duì)葛花異黃酮提取率有很大的影響[11-12]。

        為了優(yōu)化異黃酮的提取工藝,張永丹[13]、馮維希[14]等使用正丁醇/水體系,王瑤[15]等使用乙醇/乙酸乙酯體系,提取葛花中的異黃酮,并發(fā)現(xiàn)選用乙醇溶液提取的產(chǎn)率有所提高。吳桐等以乙酸乙酯/乙醇/水(體積比為4.0∶0.5∶3.0)組成三元溶劑體系,從葛根粗提物200 mg 中提取葛根素2.36 mg,鳶尾苷8.57 mg,染料木黃酮5.34 mg,經(jīng)高效液相色譜分析其純度均達(dá)到90.0%以上,為葛花中異黃酮類(lèi)活性化合物的分離純化提供了新途徑[16]。

        其他試劑如水、甲醇[17]等,也在文獻(xiàn)中有記錄過(guò)。汪新亮提出,以甲醇為溶劑的索氏提取儀提取和熱水浸提相結(jié)合的提取方法提取的葛花總異黃酮和鳶尾異黃酮產(chǎn)量均為最高,鳶尾異黃酮破壞較少。甲醇中索氏提取儀提取和水浸提相結(jié)合的提取方法為葛花中鳶尾異黃酮最佳提取方法[18]。

        2.3 其他輔助方式

        隨著現(xiàn)代儀器的發(fā)展,超聲波促融[19-20]越來(lái)越多地應(yīng)用到葛花黃酮提取的工藝流程中。代明君用超聲波技術(shù)促進(jìn)葛花異黃酮的提取,發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)葛花黃酮得率的影響程度為料液比>乙醇濃度>超聲功率>超聲時(shí)間。在此基礎(chǔ)上,他用高壓脈沖電場(chǎng)法提取葛花黃酮,在乙醇濃度60%,料液比1∶32,電場(chǎng)強(qiáng)度16 kv/cm,脈沖數(shù)8 個(gè),此時(shí)黃酮得率為10.37%,得率高于超聲波法提取葛花黃酮[21]。

        3 檢驗(yàn)方法

        目前,葛花提取物分離的常規(guī)檢驗(yàn)方法如UV 法、可見(jiàn)分光光度法及HPLC 法多見(jiàn)于文獻(xiàn)。

        3.1 UV 法(中國(guó)藥典2005 年版I 部,附錄VA)[22]

        3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

        精密稱(chēng)取20.8 mg 鳶尾苷對(duì)照品,于60℃干燥至恒重,加入乙醇制成208 μg/mL 的溶液作為對(duì)照品溶液。

        3.1.2 供樣品溶液的制備

        取過(guò)3 號(hào)篩且干燥至恒重的葛花藥材粉末約0.3 g,精密稱(chēng)定,置100 mL 帶塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇50 mL,關(guān)合,稱(chēng)重,加熱回流提取2 h,冷卻,再次稱(chēng)重,用60%乙醇補(bǔ)減量,搖勻,過(guò)濾,精密吸取濾液0.1 mL,放入10 mL 容量瓶?jī)?nèi)加入乙醇至標(biāo)準(zhǔn)刻度,最后搖勻既可。

        3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

        精密量取對(duì)照品溶液0.25 mL,0.5 mL,0.75 mL,1.0 mL,1.25 mL 分別于25 mL 量瓶中,加60%乙醇至刻度??瞻兹芤簽橐掖既芤?,觀察波長(zhǎng)狀況,達(dá)到265 波長(zhǎng)后對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)測(cè)定結(jié)果設(shè)吸光度、濃度分別為縱橫乙醇溶液為空白,在265 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)、繪坐標(biāo)可得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

        3.1.4 測(cè)定法

        依照供樣品溶液照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下方法, 對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可知樣品溶液內(nèi)鳶尾苷質(zhì)量(μg),計(jì)算結(jié)果,即得。

        3.2 可見(jiàn)分光光度法[23]

        對(duì)照品溶液和供樣品溶液的制備。準(zhǔn)確稱(chēng)取適量蘆丁,溶于80%乙醇中,制成12.32 μg/mL 的對(duì)照溶液。

        葛根用去離子水漂洗3 次,60℃干燥后壓碎,準(zhǔn)確稱(chēng)取葛根花藥粉2 g,放入索氏提取液中,用乙醚脫脂2 h 至提取物無(wú)色,蒸干乙醚,殘?jiān)?5%乙醇浸泡5 h,索氏提取4 h,直至提取物無(wú)色。濾液用95%乙醇在50 mL 容量瓶中稀釋?zhuān)灾苽涔悠啡芤骸?/p>

        總黃酮測(cè)定方法。精密吸取供樣品溶液適量,置于10 mL容量瓶中,加5%NaNO2溶液0.30 mL,搖勻,放置6 min,加入10% Al(NO3)2。溶 液0.30mL,搖 勻,再 放 置6 min,加 入4 %NaOH 4.00 mL,加蒸餾水稀釋至10.00 mL,搖勻,放置10 min,同法做空白,于506 nm 處測(cè)定吸光度。

        3.3 HPLC 法[24]

        稱(chēng)取50 mg 葛花提取物、12.5 mg 的純化物,使用80%甲醇通過(guò)超聲溶解方式置入容量瓶,定容50 mL,搖晃均勻讓微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾,可取得10μL 續(xù)濾液,后將續(xù)濾液注入高效液相色譜儀內(nèi)進(jìn)行分析。隨后在高效液相色譜儀分析過(guò)程中,對(duì)峰面積進(jìn)行記錄,采用外標(biāo)法對(duì)葛花提取物內(nèi)鳶尾苷、6"-O- 木糖鳶尾、染料木素含量進(jìn)行計(jì)算,最后將計(jì)算結(jié)果與鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品峰面積進(jìn)行百分比計(jì)算既可。

        4 小結(jié)

        (1)高效液相色譜與紫外分光光度法聯(lián)合可用于葛根的質(zhì)量評(píng)價(jià)和提取工藝的確定。兩種方法綜合評(píng)價(jià)最佳提取工藝,其結(jié)果更為科學(xué)合理。

        (2)鳶尾苷、6"-O- 木糖鳶尾苷、染料木素3 種主要黃酮類(lèi)成分的含量,可作為葛花質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)物質(zhì)。

        (3)隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,一些精密檢驗(yàn)方法,如超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/Ms)也可以應(yīng)用到葛花提取物分離中[25]。

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