馬保華， 鄧文喻， 李 賀

(1. 佛山海關(guān)綜合技術(shù)中心，廣東 佛山 528200； 2. 廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

2016年9月，國(guó)際病毒分類委員會(huì)執(zhí)委會(huì)批準(zhǔn)命名了1種新病毒——D型流感病毒(Influenza D virus，IDV)[1]。IDV是流感病毒的1個(gè)新屬成員，與A、B、C型流感病毒同屬正粘病毒科，但同A、B、C型流感病毒存在一定的差異[2，3]。IDV抗體與A型流感病毒(IAV)、B型流感病毒(IBV)、C型流感病毒(ICV)均無(wú)交叉反應(yīng)性[4]。新發(fā)現(xiàn)的D型流感病毒感染宿主范圍較廣，不但可以感染豬、牛、羊、駱駝等，還能感染人，牛被認(rèn)為是主要宿主。雖然IDV致病力不高且在哺乳動(dòng)物間傳播能力有限，但必須警惕和防范其對(duì)公共安全的威脅[4，5]。目前，已在北美、歐洲、中國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)檢測(cè)到D型流感病毒，疑似有全球分布的特征[5，6]。

1 病原學(xué)特征

1.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)

1.1.1 基因組IDV RNA基因組由7個(gè)片段組成， 共編碼PB2、PB1、P3、NP、HEF、M (M1和CM2)、NS (NEP和NS1) 等9種蛋白[3]。 進(jìn)化分析表明IDV與IAV、IBV差異很大，而與ICV最為相似。 氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)IDV跟ICV有50%的同源性。IDV每個(gè)基因片段非編碼區(qū)基因5’端 (5’-AGCAGUAGC AAG-3’) 和3’端 (3’-C/UCGUAUUCGUC-5’) 高度保守，幾乎與ICV一致。唯一不同在于IDV 3’端第5位堿基為腺嘌呤(adenine，A)，而ICV為胞嘧啶 (cytosine，C)。IDV的受體跟ICV相同，均為9-O乙酰唾液酸受體。但是序列分析表明IDV的HEF蛋白與ICV的HEF蛋白相比結(jié)合位點(diǎn)不同，所以IDV與ICV沒有血清學(xué)交叉反應(yīng)[1，4]。

1.1.2 敏感性IDV的熱穩(wěn)定性和耐酸能力對(duì)其跨種傳播能力具有重要作用。反向遺傳學(xué)研究表明HEF(hemagglutinin-esterase fusion，HEF)蛋白對(duì)IDV的熱穩(wěn)定性和耐酸能力起到關(guān)鍵作用。Yu J等[7]發(fā)現(xiàn)IDV比IAV、IBV、ICV具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性， 53 ℃加熱2 h或pH 3.0環(huán)境下作用0.5 h仍具有感染性，而其他流感病毒已完全失去感染活性。不同的細(xì)胞、組織甚至是動(dòng)物體內(nèi)pH值不同， 因此推測(cè)IDV具有較廣泛的組織嗜性和宿主感染性。

2 流行病學(xué)

2.1 易感動(dòng)物牛被認(rèn)為是IDV的天然宿主。IDV能夠感染牛、豬、雪貂、豚鼠和單峰駝并通過(guò)接觸傳播感染其他動(dòng)物。

2.2 流行特點(diǎn)目前已在北美、歐洲、中國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)檢測(cè)到IDV，疑似有全球分布的特征。根據(jù)IDV遺傳進(jìn)化關(guān)系，目前IDV主要分為D/OK、D/660和 D/Japan 3個(gè)譜系，但存在一定的交叉反應(yīng)性。D/OK全球分布，D/660主要在美國(guó)、意大利，D/Japan目前只在日本檢測(cè)出[8]。IDV可以通過(guò)直接接觸從感染動(dòng)物傳播到哨兵動(dòng)物，但不能通過(guò)氣溶膠傳播[6]。

3 致病機(jī)理

3.1最近的宏基因組研究表明，IDV、牛腺病毒3、牛鼻炎A病毒是與乳牛犢臨床常見呼吸道疾病 (Bovinerespiratory disease，BRD)相關(guān)的前3種病毒，而IDV感染是主要病因，臨床病牛的IDV檢出率顯著高于健康牛，并且傾向于與BRD顯著相關(guān)。Ferguson L等[9]將牛源IDV人工感染犢牛后能夠引起感染犢牛的氣管炎癥，并出現(xiàn)干咳、流鼻涕等輕微呼吸道癥狀，證明IDV比較容易感染牛群且發(fā)生接觸傳播。Ferguson L等[9]通過(guò)人工模擬自然狀態(tài)下流感傳播途徑，利用2只雪貂接觸感染牛群的鼻分泌液污染物，結(jié)果2只雪貂血清IDV抗體檢測(cè)呈陰性。雖然IDV能夠感染并引起牛群的輕微呼吸系統(tǒng)疾病， 但其通過(guò)排泄污染物傳染給人的風(fēng)險(xiǎn)仍較低。也有研究認(rèn)為單獨(dú)感染IDV不足以引起疾病，IDV感染可能是BRD復(fù)合體的一部分，需要感染1種(或多種)呼吸道病毒，使宿主易于接觸呼吸道的細(xì)菌定植[3，10]。

3.2研究發(fā)現(xiàn)，IDV感染豬后在鼻甲中復(fù)制，并且在鼻拭子中可檢測(cè)到病毒脫落；病毒也可通過(guò)直接接觸傳播給幼稚動(dòng)物；在氣管和肺中未檢測(cè)到病毒，表明病毒復(fù)制僅限于上呼吸道；沒有觀察到典型流感的臨床癥狀和病變[10]。Sreenivasan C等[11]利用豚鼠構(gòu)建IDV哺乳動(dòng)物感染模型，IDV在豚鼠鼻甲、肺、呼吸道等組織內(nèi)可有效復(fù)制，并能在豚鼠間傳播。

3.3高福團(tuán)隊(duì)通過(guò)糖點(diǎn)陣芯片實(shí)驗(yàn)證明IDV能結(jié)合9-O乙酰唾液酸受體及其多種衍生物。IDV HEF蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)的開放通道使得IDV能夠容納不同的糖環(huán)構(gòu)象，從而結(jié)合9-O乙酰唾液酸受體及其不同衍生物，為其廣泛的細(xì)胞嗜性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?？蒲腥藛T通過(guò)組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IDV HEF蛋白能結(jié)合人、豬、牛的氣管纖毛上皮細(xì)胞?？紤]到IDV不僅能夠?qū)е屡：拓i發(fā)病，而且能夠在雪貂和豚鼠中傳播，必須警惕和防范其對(duì)公共安全的威脅[1]。翟少倫研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了在廣東省IDV的流行情況，尤其是在某些嚴(yán)重病例中鑒定了IDV的病毒血癥，以及檢測(cè)到動(dòng)物下呼吸道和腸道中IDV的存在[12]。這些新的發(fā)現(xiàn)異于先前的研究報(bào)道，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

4 檢測(cè)方法

目前針對(duì)IDV的診斷并沒有特殊的方法，與其他類型流感一樣主要采用病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

4.1病毒分離培養(yǎng)是流感病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可以采用細(xì)胞培養(yǎng)方法。IDV的細(xì)胞嗜性較為廣泛，能在豬睪丸細(xì)胞(ST)、肺癌細(xì)胞(A549)、犬腎細(xì)胞(MD-CK)、非洲綠猴腎細(xì)胞 (Marc-145)、人直腸癌細(xì)胞(HRT-18G)等多種細(xì)胞中生長(zhǎng)繁殖。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要包括血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)[3]。Moreno A等[13]利用單克隆抗體建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。

4.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 具有快速、準(zhǔn)確、敏感等特點(diǎn)，目前IDV鑒別診斷多采用此方法。研究表明流感病毒基因組中PB1基因序列最為保守，目前大部分是基于IDV的PB1基因建立PCR檢測(cè)方法。Hause B M等[4]根據(jù)IDVPB1基因 (1 420～1 555 bp 區(qū)間) 設(shè)計(jì)引物，建立了IDV Taqman熒光定量PCR檢測(cè)方法。Faccini S等[14]根據(jù)GenBank公布的IDV分離株序列的PB1基因保守區(qū)域 (1 215～1 323 bp) 設(shè)計(jì)引物， 建立了兩步法熒光定量PCR。Henritzi D等[15]建立了同時(shí)檢測(cè)A、B、C、D四型流感的四重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法。

5 預(yù)防

由于IDV發(fā)現(xiàn)時(shí)間較短，目前尚未有商品化疫苗和特異性治療藥物。Hause B M等[16]將D/bovine/Kansas/162655/2012滅活后制備全病毒滅活疫苗，免疫牛后雖然能顯著降低IDV排毒量，但保護(hù)作用達(dá)不到100%。Wan Y 等[17]設(shè)計(jì)了1種表達(dá)HEF蛋白的DNA疫苗，可以保護(hù)動(dòng)物免受IDV D/OK、D/660的攻擊，效果良好。

6 展望

新發(fā)現(xiàn)的D型流感病毒感染宿主范圍較廣，不但可以感染豬、牛、羊、駱駝等，還能感染人。鑒于當(dāng)前IDV流行范圍不斷擴(kuò)大，并且在流行過(guò)程中比ICV容易發(fā)生變異，加之熱穩(wěn)定性好、耐酸，在自然環(huán)境中容易存活，因此值得高度關(guān)注。其致病機(jī)制、診斷方法以及疫苗研發(fā)等相關(guān)研究都比較少，值得深入研究和探索。