姚祺 何嘏娜

研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a（微小RNA-26a）于乳腺癌、肝癌、胃癌以及鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)下降，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用[1-3]。相關(guān)文獻(xiàn)表示卵巢癌患者血清及卵巢癌組織中miR-26a 表達(dá)下調(diào)，卵巢患者癌組織中TFAP2C（轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白2C）表達(dá)水平越高則患者預(yù)后越差，其和患者臨床分期為正相關(guān)，處于進(jìn)展期的卵巢癌患者其TFAP2C 表達(dá)陽(yáng)性率明顯比早期患者高[4-5]。有文獻(xiàn)表示調(diào)控miR-26a 的靶基因之一就是TFAP2C[6]。為進(jìn)一步提高卵巢癌的治療效果，本文就miR-26a 調(diào)節(jié)TFAP2C 表達(dá)而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖效果進(jìn)行探討分析。

1 資料和方法

1.1 一般資料

所選擇的病例對(duì)象均為卵巢癌患者，共有60 例，收集時(shí)間為2018 年11 月—2019 年12 月，患者年齡38 ～68 歲，平均年齡為（52.31±2.09）歲。所有患者均經(jīng)臨床癥狀、體征以及實(shí)驗(yàn)室檢查確診是卵巢癌，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者及其家屬的知情同意。

1.2 研究方法

所需材料有miR-26a 模擬物、CAOV3（Caov3 Cell Line）（卵巢癌細(xì)胞株）、TFAP2C 抗體、RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清、轉(zhuǎn)染試劑、MTS 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖/毒性檢測(cè)檢測(cè)試劑。取適量組織，以RNA 提取試劑體完成總RNA 的提取，同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（互補(bǔ)脫氧核糖核酸），其中PCR 擴(kuò)增反應(yīng)是20 μL 體系，包含有TaqDNA polymerase 0.2 μL，MiR-PCR primers 0.4 μL，2×SYBRMix 10 μL，滅菌蒸餾水以及miRNA RTproduct 2.0 μL。本次研究采用的循環(huán)體系共35 個(gè)，具體如下：95℃×3 min；95℃×12 s，72℃×30 s，62℃×35 s。將U6snRNA 作為內(nèi)參，以2-△△CT 法來(lái)測(cè)定分析miR-26a 相對(duì)表達(dá)量。人卵巢癌CAOV3 細(xì)胞含有10%胎牛血清RPMI1640 培養(yǎng)液，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境：37℃，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%。細(xì)胞為單層貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%的時(shí)候?qū)嵤┏Ｒ?guī)傳代。TFAP2C mRNA 的檢測(cè)方式同上，以2-△△CT 法來(lái)檢測(cè)TFAP2C mRNA 相對(duì)表達(dá)量。把miR-26a 模擬物或者TFAP2C siRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至卵巢癌CAOV3 細(xì)胞，在48 h 以后進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取工作，以BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。每組均取相同數(shù)量的樣本，實(shí)施SDS-PAGE 凝膠電泳，接著把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，以5%BSA 進(jìn)行封閉，而后添加TFAP2C 或者GAPDH 抗體，在4℃條件下過(guò)夜。經(jīng)TBST 洗膜半小時(shí)，添加二抗室溫進(jìn)行1 h孵育；以TBST 洗膜半小時(shí)，添加ECL 發(fā)光劑，通過(guò)X 片曝光、顯影以及定影工作。提取經(jīng)轉(zhuǎn)染的卵巢癌CAOV3 細(xì)胞，完成消化以后接種細(xì)胞在96 孔板中，每一個(gè)孔有5 000 個(gè)細(xì)胞，各組設(shè)有6 個(gè)復(fù)孔，將其放置在溫度為37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。把RPMI-1640 培養(yǎng)基添加到?jīng)]有接種細(xì)胞的孔中，將其當(dāng)做凋零孔。在接種72 h 以后，在各孔中加入20 μL MTS 檢測(cè)試劑，在溫度為37℃下進(jìn)行孵育，時(shí)間2 h，借助于酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm 波長(zhǎng)吸光度值，共進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察患者miR-26a 表達(dá)量、 TFAP2C 表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件。計(jì)量資料用（±s）表示。計(jì)數(shù)資料用（n，%）表示。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者miR-26a 表達(dá)量為（0.68±0.15）[ 正常人表達(dá)量范圍（5.35±0.44）]，TFAP2C 表達(dá)量為（3.87±1.02）。通過(guò)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，和陰性對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染miR-26a 組、TFAP2C siRNA 組 TFAP2C 表達(dá)水平明顯要低，可見(jiàn)miR-26a 可下調(diào)卵巢癌CAOV3 細(xì)胞系中TFAP2C 的表達(dá)（圖1）。分別 把miR-26a 模擬物（miR-26a -mimics）、miR-26acontrol 組（陰性對(duì)照組）和TFAP2C siRNA（ siRNA 組）、siRNA-control（陽(yáng)性對(duì)照組）及轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞24 h、48 h以及72 h 以后，經(jīng)MTT 法檢測(cè)miR-26a 對(duì)于細(xì)胞增殖的影響。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TFAP2C siRNA 組（0.53±0.12）、miR-26a 模擬物組（0.51±0.02）癌細(xì)胞增殖率速度減慢，和miR-26a-control 組（1.01±0.23）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢?jiàn)高表達(dá)miR-26a 經(jīng)下調(diào)TFAP2C 的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖（如圖2）。

圖1 Western blot 檢測(cè)miR-26a 對(duì)TFAP2C 的影響

圖2 miR-26a 和TFAP2csiRNA 對(duì)CA0V3 細(xì)胞增殖的抑制

3 討論

調(diào)查研究表明，在女性生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率中卵巢癌占據(jù)前列，早期患者生存率較高，然而實(shí)踐發(fā)現(xiàn)大部分患者到院就診時(shí)已處于晚期，同時(shí)多數(shù)患者在實(shí)施化療時(shí)很容易產(chǎn)生耐藥性，因此急需尋找更為有效的藥物進(jìn)行治療[7-8]。研究表明，miR-26a 于肝癌中的表達(dá)水平高低和患者生存時(shí)間、對(duì)干擾素治療的敏感程度密切相關(guān)；miR-26a 鼻咽癌中表達(dá)水平降低，并且可經(jīng)靶基因組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)以及增殖產(chǎn)生抑制作用[9]。另外miR-26a 于乳腺癌組織以及乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)，可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，且過(guò)表達(dá)miR-26a 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。本文筆者就miR-26a 調(diào)節(jié)TFAP2C 表達(dá)而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖效果進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者miR-26a 于卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)顯著。有文獻(xiàn)報(bào)道，TFAP2C 為miR-26a 調(diào)節(jié)的靶基因，本次研究也證實(shí)該理論。TFAP2 作為重要轉(zhuǎn)錄因子之一，經(jīng)和其靶基因啟動(dòng)子上作用元件結(jié)合對(duì)靶基因特異性表達(dá)進(jìn)行控制，以此對(duì)細(xì)胞遷移、凋亡、分化以及增殖等進(jìn)行調(diào)控[11]。有報(bào)道表示TFAP2C 和腫瘤基因不穩(wěn)定、腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、抗凋亡以及藥物抵抗存在著密切的關(guān)系[12-13]。本次研究還發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-26a或者干擾TFAP2 以后可顯著抑制癌細(xì)胞增殖活力，由此可見(jiàn)，miR-26a 可能經(jīng)下調(diào)TFAP2C 表達(dá)量對(duì)卵巢癌細(xì)胞CAOV3 增殖產(chǎn)生抑制作用。

綜上，卵巢癌細(xì)胞中miR-26a 表達(dá)量下調(diào)，可經(jīng)調(diào)控TFAP2C 的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，臨床中可加強(qiáng)miR-26a 觀察和調(diào)控。