（聊城大學生命科學學院，聊城 252059）

蜂膠是由蜜蜂采集樹脂并混入蜂蠟、花粉及自身腺體分泌物所得到的一種天然產(chǎn)物[1]，蜂膠的化學成分具有高度的復雜性和可變性[2]。迄今為止從蜂膠中鑒定出的化學組分高達 20多類、600多種，主要有黃酮類、酚酸類、萜烯酸、類固醇類、氨基酸類等[3]。由于蜂膠復雜的化學組分，使得蜂膠具備豐富而獨特的生物活性，如抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤及免疫調節(jié)等功效[4-8]。目前蜂膠廣泛應用于食品、保健品和藥品等行業(yè)，但其功效成分和作用機理還未完全闡明。

我們前期研究了蜂膠中分離純化出的11種化學成分（咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素）的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)蜂膠中酚酸類物質的抗腫瘤功效較弱，黃酮及其酯類具有較好的抗腫瘤活性[9,10]；但蜂膠中這些抗腫瘤功效成分之間相互作用目前還缺乏研究。此外，前期通過不同濃度（40%～90%）的甲醇-水洗脫，我們從蜂膠乙酸乙酯提取物中分離出8段組分（Ⅰ-Ⅷ），并研究了這8段組分的抗炎功效，發(fā)現(xiàn)這8段組分對蜂膠的抗炎功效均有作用[11,12]。但這8段組分的抗腫瘤功效與抗炎功效是否相同，目前還不清楚?；诖?，本研究通過8種不同腫瘤細胞，詳細研究了不同濃度甲醇-水（40%～90%）洗脫的蜂膠中8段組分（Ⅰ-Ⅷ）的抗腫瘤功效，為蜂膠的抗腫瘤活性應用及質量控制提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

肺癌細胞（A549和H1299）、乳腺癌細胞（MCF-7和MDA-MB-231）、食管癌細胞（Eca109和TE-11）、膠質瘤細胞（U87）和宮頸癌細胞（HeLa）均由本實驗室保存。

中國蜂膠產(chǎn)自山東省，膠源植物主要為楊屬植物；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰酶、磺酰羅丹明B（SRB）（sigma）；細胞培養(yǎng)皿、96孔板（Fisher公司）；Tris（上海生工）；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

HFsafe1200超凈工作臺、MCO-17A CO2培養(yǎng)箱（上海力康科學儀器有限公司）；TE2000S 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；MK3酶標儀（芬蘭雷勃公司）；AR2140電子分析天平（美國奧豪斯公司）；優(yōu)普超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 蜂膠脂溶性部位主要成分的制備、分離和鑒定

蜂膠水提物的殘渣經(jīng)乙酸乙酯浸提，然后經(jīng)40%～90%濃度的甲醇-水洗脫，得到8段組分（Ⅰ-Ⅷ），具體步驟見參考文獻[12]。其中，分離得到的8段組分，通過HPLC-DAD/Q-TOF-MS分析檢測，主要成分見參考文獻[12]。

1.3.2 細胞的培養(yǎng)

A549、H1299、MCF-7、MDA-MB-231、Eca109、TE-11、U87和HeLa細胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基或PRIM-1640培養(yǎng)基中。孵育條件為：5% CO2、37°C、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.3.3 細胞存活率的測定

將處于對數(shù)生長期的8種不同腫瘤細胞按4000個/孔種植到96孔板中，37℃、5% CO2孵育，待細胞長到60%以上，分別經(jīng)25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的Ⅰ-Ⅷ 8段組分處理24h和48h。棄細胞培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸4℃固定1h，水洗，晾干；然后用SRB染色10min，水洗，晾干；最后用100mM Tris堿溶解已著色的細胞，在492nm處測吸光值。

細胞存活率（%）=（處理組OD值/對照組OD值）×100%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采取均數(shù)±標準差（±S）表示，用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 蜂膠中8段組分對肺癌A549和H1299細胞存活率的影響

肺癌是嚴重威脅人體健康的第一大惡性腫瘤。首先我們檢測了蜂膠中8段組分（25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml）對兩種肺癌細胞A549和H1299的存活率的影響。由圖1可以看出，Ⅰ-Ⅷ 8段組分對A549和H1299細胞存活率的影響不同。在24h，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段組分對A549細胞增殖抑制功效顯著；而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對H1299細胞抑制效果顯著；在48h，隨著作用時間的延長，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段組分對A549細胞的抑制功效較24h顯著，且呈劑量依賴性。同樣，在48h，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對H1299細胞增殖的抑制功效隨時間和濃度的增加效果也顯著增強，而且Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段對H1299的抑制功效比對A549細胞的抑制功效更顯著。

圖1 蜂膠中8段組分對肺癌A549和H1299細胞存活率的影響

2.2 蜂膠中8 段組分對乳腺癌MCF-7和MDAMB-231細胞存活率的影響

MCF-7是雌激素受體陽性的乳腺癌細胞，而MDA-MB-231細胞是三陰性乳腺癌細胞，具有更高的浸潤和轉移特征，預后效果較差。接著，我們檢測了蜂膠中8段組分（25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml）對兩種乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231存活率的影響。由圖2可以看出，蜂膠中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖的抑制效果具有時間和劑量的依賴性，而且在48h，蜂膠中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對MDA-MB-231細胞增殖的抑制效果較MCF-7更顯著。

圖2 蜂膠中8段組分對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞存活率的影響

2.3 蜂膠中8段組分對食管癌Eca109和TE-11細胞存活率的影響

食管癌是一種消化道惡性腫瘤，我國是食管癌的高發(fā)區(qū)。我們檢測了蜂膠中8段組分分別對兩種食管癌細胞Eca109和TE-11存活率的影響。如蜂膠中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制兩種乳腺癌細胞一樣，蜂膠中這四段組分抑制Eca109和TE-11細胞增殖也是呈時間和劑量依賴的，而且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對TE-11細胞的抑制功效較Eca109細胞更強。

圖3 蜂膠中8段組分對食管癌Eca109和TE-11細胞存活率的影響

2.4 蜂膠中8段組分對膠質瘤U87和宮頸癌HeLa細胞存活率的影響

由圖4A可以看出，蜂膠中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制膠質瘤U87細胞增殖隨時間和劑量的增加，抑制效果也越顯著。在24h時，蜂膠中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對HeLa細胞的抑制功效較其他段（Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ）顯著；在48h，除蜂膠中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制HeLa細胞增殖外，蜂膠中Ⅱ段也顯著抑制HeLa細胞增殖。

圖4 蜂膠中8段組分對U87和HeLa細胞存活率的影響

3 討論

蜂膠的化學成分十分復雜，目前蜂膠應用中最大的難題就是藥效不穩(wěn)定，藥效物質基礎不明確。本實驗通過8種不同的腫瘤細胞研究了蜂膠乙酸乙酯提取物經(jīng)40%～90%甲醇-水洗脫后得到的8段化合物的抗腫瘤功效。結果發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段對8種不同的腫瘤細胞均有抑制功效，Ⅱ和Ⅵ對某些腫瘤細胞也具有一定的抑制功效。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段甲醇-水的洗脫濃度在60%～75%之間，說明在這個濃度范圍內(nèi)，蜂膠乙酸乙酯提取物中的主要抗腫瘤功效成分被洗脫出來。盡管Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段甲醇-水的洗脫濃度較高，但是由于蜂膠中主要抗腫瘤功效成分已經(jīng)在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脫出來，所以Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段對8種腫瘤細胞的抑制功效不顯著；同樣Ⅰ、Ⅱ段甲醇-水濃度較低，蜂膠中主要抗腫瘤功效組分洗脫下來的比較少，其抗腫瘤功效也較弱。這說明，首先甲醇-水的濃度決定了蜂膠乙酸乙酯提取物中抗腫瘤功效成分能否被洗脫下來；其次，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脫的甲醇-水濃度不同，其化學組分盡管不完全相同，但其對8種不同的腫瘤細胞均具有抑制功效，說明蜂膠抗腫瘤的功效成分是多種化合物共同作用的結果，而且主要是黃酮類化合物和酯類的種類和含量決定的，在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脫成分中，黃酮類化合物和酯類物質種類多，含量高；再次，通過Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段化學成分分析可以看出，盡管Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段中可能某一蜂膠抗腫瘤功效成分如白楊素含量較高，但其他抗腫瘤功效組分含量較少，導致Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段抗腫瘤功效也不顯著，說明蜂膠的抗腫瘤功效是由蜂膠中抗腫瘤功效成分的種類和含量決定的，兩者缺一不可。

前期我們首先在蜂膠中分離出11種單體，測定了每一種單體的抗腫瘤功效，確定在蜂膠中發(fā)揮抗腫瘤活性的主要是黃酮類和酯類[10]。本實驗通過不同濃度的甲醇-水洗脫出8段不同的組分，進一步確定了蜂膠抗腫瘤功效成分之間的相互作用和決定蜂膠抗腫瘤功效的關鍵因素。本實驗研究為蜂膠的質量評價體系提供了一定的參考價值。