施海燕 宋美潔 趙玲玲 齊素貞 吳黎明 薛曉鋒

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2 北京百花蜂業(yè)科技發(fā)展股份公司，北京 100176）

氯霉素是從微生物代謝物中分離的一種廣譜抗生素，目前通過人工合成已廣泛用于動物各種傳染性疾病的治療。但是氯霉素有較強(qiáng)的毒副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，因此動物食品中的氯霉素殘留對人類健康構(gòu)成了潛在危害[1]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織于1994年決定禁止使用氯霉素，許多國家禁止此藥用于生產(chǎn)食品動物，并規(guī)定了其在畜產(chǎn)品中最高限量。其中，各國對蜂蜜中氯霉素的殘留限量作了嚴(yán)格規(guī)定，如美國0.3μg/kg、日本5μg/kg、加拿大1μg/kg及歐盟0.1μg/kg[2]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定氯霉素在蜂蜜中不得檢出。氯霉素殘留檢測已經(jīng)成為進(jìn)出口蜂產(chǎn)品的重點監(jiān)測指標(biāo)[3,4]，保證氯霉素殘留檢測結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠，對于提高監(jiān)管機(jī)構(gòu)執(zhí)法能力和保障企業(yè)的合法利益具有重要的意義。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是分析技術(shù)重要的技術(shù)物質(zhì)保障。加快農(nóng)業(yè)領(lǐng)域基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)，是提高農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新能力、促進(jìn)農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和增強(qiáng)我國農(nóng)產(chǎn)品市場競爭力的必然要求?；w標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在保證分析方法的準(zhǔn)確性及可溯源性方面具有重要作用[5]。在日常的檢測工作中，檢測人員經(jīng)常通過人為添加藥物到基體中形成一個“陽性”樣品，并通過測定回收率來評判方法和檢測結(jié)果的可靠性。然而，藥物在生物體內(nèi)代謝復(fù)雜，結(jié)合形式多樣，在提取方法、提取溶劑的使用方面同人為添加藥物殘留的檢測不同，因此，人為添加的樣品不一定真實反映藥物在基體的實際情況，不能完全保證檢測結(jié)果真實可靠[6]。自然基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求其候選材料獲取于天然基體，目標(biāo)物和基體結(jié)合情形與真實檢測樣品完全一致，可有效避免基體效應(yīng)對物質(zhì)成分分析的影響。

我國已有多種食品分析用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類食品的實驗室能力考核、檢測機(jī)構(gòu)能力比對、企業(yè)實驗室的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制等[7]。但關(guān)于蜂蜜基體標(biāo)物研究較少，僅有蜂蜜中磺胺和羥甲基糠醛的基體標(biāo)物有報道，目前尚未見蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制報道。本文以洋槐蜂蜜為基體，通過實際的蜂場飼喂方式，研制了蜂蜜中的氯霉素殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Aglient 1260液相色譜（美國Aglient公司）；AglientUltivo Tripe Auad MS 6465B（美國Aglient公司）；METTLER XS105十萬分之一天平，METTLER AL104萬分之一天平，50ml、25ml棕色容量瓶（均為A級），10ml棕色容量瓶（B級），2.0ml單標(biāo)線吸量管（A級），1000μl可調(diào)移液器（最大允許誤差為1.0%）、100μl可調(diào)移液器（最大允許誤差為2.0%）均已通過北京市計量檢測科學(xué)研究院校準(zhǔn)和檢定；高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）；Vortex-Genie 2型渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；BAKERBOND固相萃取儀（美國Waters公司）；水浴氮吹儀（美國Organomation公司，N-EVAPTM 111，OA-SYSTM水浴加熱裝置）。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氨水（LC-MS級別，美國Fisher公司）；甲酸（LC-MS級別，德國Sigma公司）；實驗室用水為經(jīng)Milli-Q凈水系統(tǒng)（0.22μm過濾膜）過濾的去離子水；氯霉素購自中國農(nóng)科院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，為國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號GBW（E）082557，標(biāo)準(zhǔn)值100mg/l，不確定度3mg/l（k=2）；氯霉素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品（D5-氯霉素）純度為100mg/l，德國Dr.Ehrenstorfer公司。SPE萃取小柱：Oasis HLB柱（6ml 200mg，美國Waters公司）。Bond ElutQuEChERS試劑盒（型號：5982-0032）及QuEChERS d-SPE EMR-lipid（part no.5982-5158）均購于安捷倫科技有限公司（Santa Clara，USA）。

1.2 氯霉素陽性樣品的制備

選取兩個蜂場，取18kg洋槐蜂蜜，人工加入2kg果糖混合進(jìn)一步調(diào)節(jié)葡萄糖和果糖的比例，防止蜂蜜結(jié)晶。飼喂該添加果糖的蜂蜜樣品獲得空白樣品；再通過添加1μg/kg的氯霉素藥物于該飼喂的蜂蜜混合物中，飼喂蜜蜂一周后，取部分樣品經(jīng)初步測試，作為樣品的基體標(biāo)物候選物。

1.3 樣品的分析方法

1.3.1 樣品的前處理方法

蜂蜜基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)解凍后震蕩均勻，準(zhǔn)確稱取5.0g（精確至0.1mg）于50ml塑料離心管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中添加的內(nèi)標(biāo)濃度，準(zhǔn)確量取200μg/kg的氯霉素-D5溶液23.0mg（約25μl，準(zhǔn)確記錄天平質(zhì)量），渦旋30s后4℃平衡1h。

提取與凈化：在離心管中加入5ml水，渦旋震蕩混勻1min；再加入10ml 1%氨水乙腈溶液（V/V）提取，渦旋提取1min；加入Agilent 5982-0032鹽包一袋，渦旋混勻2min，4℃ 8000r/min離心5min；取6ml上層提取液加入Agilent 5982-5158凈化包中，渦旋凈化1min，4℃ 8000r/min離心5min；取上層凈化液2ml，氮氣吹干，最后加入準(zhǔn)確稱取的50%乙腈水溶液1.0g，充分溶解，溶解液過0.22μm濾膜，上機(jī)。

表1 液相色譜洗脫程序

1.3.2 儀器分析條件

液相色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1×50mm，1.8μm）色譜柱；流動相A為水，流動相B為乙腈。溫度：40℃。優(yōu)化洗脫程序，確定梯度洗脫程序如表1所示。

質(zhì)譜條件：AJS ESI離子源負(fù)離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；電離電壓：3500V；霧化器和碰撞氣：氮氣；霧化器溫度：300℃；霧化器流速：6l/min；霧化器壓力40psi；氣簾氣流速：12l/min；氣簾氣溫度：350℃；定量離子對信息如表2所示。

1.4 樣品的均勻性和穩(wěn)定性檢驗

1.4.1 均勻性檢驗

根據(jù)《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》（JJF 1006-1994）和《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理的要求》（JJF 1343-2012），對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗。記總體單元數(shù)為N，當(dāng)N≤200時，抽樣單元數(shù)不少于11個。從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝中隨機(jī)抽取11個包裝，記錄編號為CAP-X（X為1，2，3，…），每個包裝樣品測定3個子樣，每個子樣中最小取樣量為5.0g，平行測定3次。按照液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行測試并對測量的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（具體方法及參數(shù)見標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值部分）。方差分析法是用來統(tǒng)計檢驗均勻性最常用的方法，通過組間方差和組內(nèi)方差的比較來判斷不同包裝單元蜂蜜中氯霉素含量的測量值之間有無系統(tǒng)性差異。如果二者的比小于統(tǒng)計檢驗的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的。

1.4.2 穩(wěn)定性檢驗

穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本屬性，用于描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值隨時間變化的性質(zhì)，即描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性的時間分布特征。為考察蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在長期儲存條件以及外部環(huán)境變化條件影響下，物質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)和特性量值保持不變的能力，本研究根據(jù)JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》的要求，采用直線擬合法對蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值開展長期和短期的穩(wěn)定性評估考察。

1.5 樣品的定值和不確定評估

1.5.1 定值方法

本項目蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，采用液相色譜-同位素稀釋-串聯(lián)質(zhì)譜法作為測量方法，8家實驗室聯(lián)合定值。8家實驗室的定值數(shù)據(jù)經(jīng)過科克倫檢驗和格布拉斯檢驗，數(shù)據(jù)等精度、無界外值，可保留并參與最終定值。

表2 氯霉素及其內(nèi)標(biāo)物MRM離子對信息

表3 洋槐蜂蜜原料的基本理化指標(biāo)

1.5.2 不確定評估

蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過程中引入的不確定度來源主要由3部分組成：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性引入的不確定度和、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值引入的不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 基體標(biāo)物材料的制備

根據(jù)已有研究及不同品種蜂蜜的性質(zhì)，當(dāng)果糖和葡萄糖比例（果葡比）大于1.3∶1時，蜂蜜不易結(jié)晶[8]。由于洋槐蜂蜜富含果糖且在長期保存過程中穩(wěn)定不易結(jié)晶，雜質(zhì)少且質(zhì)地均勻，更適宜作為基體標(biāo)物的原料。因此，本研究取洋槐蜜作為基體，通過飼喂意大利蜂種蜜蜂以獲得含有氯霉素藥物殘留的蜂蜜基體樣品。

選擇符合監(jiān)測濃度的樣品（與市場上監(jiān)測的氯霉素陽性樣本平均含量接近）經(jīng)過搖蜜、過濾、均質(zhì)、混勻等一系列工藝過程，得到約3500g的蜂蜜樣本。獲取的洋槐蜜的各項基本理化指標(biāo)參數(shù)如下表3所示。

將獲得的蜂蜜基體原料通過初步測試，其不易結(jié)晶，容易均質(zhì)均勻。通過蜂蜜均質(zhì)分裝儀用鋁袋真空分裝并封口，得到200單元每袋約15g的基體標(biāo)物樣本，于-20℃冷凍條件下儲存，進(jìn)行后續(xù)的標(biāo)物均勻性、穩(wěn)定性和定值等。

2.2 均勻性檢驗

氯霉素蜂蜜基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗結(jié)果見表4。

上述實驗數(shù)據(jù)表明，蜂蜜中氯霉素特性量值均通過F檢驗，表明基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，滿足技術(shù)規(guī)范要求。

表4 蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗結(jié)果(μg/kg，n=3）

表5 蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果（μg/l）

表6 蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多家合作定值結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性檢驗

將分裝的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于冰箱-20℃冷凍條件下保存，從2018年8月開始到2019年8月，本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已進(jìn)行了12個月的穩(wěn)定性考察，考察結(jié)果顯示在該包裝儲存條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在12個月內(nèi)是穩(wěn)定的，結(jié)果見表5。

采用趨勢分析對監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行考察，4℃、20℃（常溫）和40℃條件下氯霉素濃度可保持14天無明顯變化，在3種不同溫度條件下氯霉素濃度標(biāo)準(zhǔn)偏差無明顯差別，因此，本基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對運輸過程中溫度要求并不嚴(yán)格，可以在低于40℃條件下短期運輸。

2.4 定值與不確定評估

2.4.1 聯(lián)合定值

根據(jù)JJF 1006-1994一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求，針對一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值可采用兩種不同原理的方法同時定值，或者采用一種方法多家實驗室聯(lián)合定值的方式。國際物質(zhì)量咨詢委員會（CCQM）將同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）定位于具有絕對測量性質(zhì)的方法，IDMS方法是唯一公認(rèn)的痕量和超痕量分析權(quán)威測量方法[9]。然而，復(fù)雜基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般難以滿足兩種不同原理方法同時定值，通常采用國際計量領(lǐng)域公認(rèn)的、權(quán)威的絕對測量方法——IDMS結(jié)合多家實驗室聯(lián)合定值的方式[10]。另外，同位素內(nèi)標(biāo)法可以減少儀器及樣品提取率等一系列誤差和基質(zhì)干擾。因此，本實驗室采用建立的高準(zhǔn)確度的IDMS方法對蜂蜜中的氯霉素進(jìn)行定值測定，定值結(jié)果由國內(nèi)8家檢測實驗室驗證。

8家實驗室的定值數(shù)據(jù)經(jīng)過科克倫檢驗和格布拉斯檢驗，數(shù)據(jù)等精度、無界外值，可保留并參與最終定值，結(jié)果見表6。

根據(jù)《GB/T 4883-2008數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和解釋-正態(tài)樣本離群值的判斷和處理》，首先采用狄克遜準(zhǔn)則對各實驗室定值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計檢驗，將定值結(jié)果按照由小到大的順序排列：

x(1)=0.61，x(2)=0.62，x(3)=0.62，

……

x(n-2)=0.84，x(n-1)=0.86，x(n)=0.88

又因為

同時，8家實驗室均采用同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜方法作為定值方法，可以認(rèn)為屬于同等精度方法。從這一點出發(fā)，進(jìn)一步采用科克倫（Cochran）準(zhǔn)則判斷這8組數(shù)據(jù)有無哪一組是可疑數(shù)據(jù)，按照標(biāo)準(zhǔn)，這里n取多數(shù)實驗室的測量次數(shù)9。

根據(jù)科克倫準(zhǔn)則，計算統(tǒng)計量：

查表得C（0.05,8,8）=0.3043，則C＜C（0.05,8,3）,判斷無可疑數(shù)據(jù)。經(jīng)過狄克遜和科克倫檢驗，數(shù)據(jù)等精度、無界外值，均符合定值要求。因此，蜂蜜氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量為多家聯(lián)合定值結(jié)果平均值0.72mg/kg。

2.4.2 不確定評估

蜂蜜中氯霉素的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度是由均勻性、穩(wěn)定性和定值引入的不確定度3部分組成，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成相對不確定度計算結(jié)果如下：即

k=2時的相對擴(kuò)展不確定度：

3 結(jié)論

本研究通過蜂場飼喂給藥方式獲得了適合濃度的氯霉素自然污染的陽性樣品。采用同位素稀釋質(zhì)譜法和多家實驗室聯(lián)合定值的方式，制備了蜂蜜氯霉素殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。所獲得的氯霉素基體標(biāo)物，量值可靠，均勻性和穩(wěn)定性良好?？梢杂糜趯嶒炇曳涿壑新让顾貧埩魴z測能力比對、實驗室數(shù)據(jù)質(zhì)量控制以及進(jìn)出口企業(yè)原料蜂蜜中氯霉素殘留檢測的質(zhì)控樣品。本項目研究的蜂蜜基體標(biāo)物對進(jìn)一步開展蜂蜜中的各類殘留基體標(biāo)物的研制具有參考價值。