王曄陽 趙健元

近年來，自閉癥譜系障礙(ASD)的發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢[1]。ASD的生物學(xué)基礎(chǔ)復(fù)雜。有研究報道，ASD患者的同型半胱氨酸(Hcy)水平在幼年和成年階段均顯著高于正常范圍[2, 3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，異常激活的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MARS)將Hcy錯誤編輯為高能同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯(HTL)，對相關(guān)蛋白形成N-Hcy修飾，從而使蛋白功能受到影響[4]。本文通過研究受N-Hcy修飾影響的蛋白及其功能改變，進一步探討ASD的潛在發(fā)生機制。

1 方法

1.1 人體樣本來源 ASD患兒和對照組兒童外周血cDNA樣本來自本課題組前期研究[5]。

1.2 細胞株和動物來源 人胚腎上皮細胞系HEK-293T和小鼠神經(jīng)干細胞NE-4C細胞系均來自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22來自中國微生物菌種查詢網(wǎng)，野生型C57BL/6J小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。

1.3 實時熒光定量PCR 將NE-4C細胞用不同濃度梯度(0、0.25、0.50、1.00 mmol·L-1)Hcy處理25 h，抽提細胞RNA并行反轉(zhuǎn)錄(諾唯贊公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒)。以β-actin和GAPDH作為內(nèi)參，利用在線軟件PrimerBank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)設(shè)計MARS、GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因的引物，用熒光定量PCR試劑盒(諾唯贊公司)進行檢測。

1.4 串聯(lián)親和純化法 檢測MARS互作蛋白的TAP法參考本課題組前期研究[6]。

1.5 免疫沉淀 為檢測Hcy對MeCP2的修飾，將NE-4C細胞用4 mmol·L-1Hcy處理，收集細胞裂解液，加入碘乙酰胺保護巰基，取上清并與MeCP2抗體(Abcam公司，貨號ab2828)和G蛋白孵育，沉淀后收集Hcy處理的MeCP2蛋白，一部分經(jīng)胰酶酶切、干燥后用于液相質(zhì)譜實驗，一部分用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，檢測MeCP2的Hcy修飾情況。Hcy修飾抗體為實驗室自制[6]。

1.6 凝膠遷移實驗(EMSA) 為檢測Hcy修飾對MeCP2功能的影響，用帶羧基熒光素(FAM)標(biāo)簽的甲基化、非甲基化DNA和 MeCP2、HTL(0、1、4 mmol·L-1)互作，反應(yīng)后用于DNA印跡實驗。

1.7 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP) 為檢測Hcy修飾對MeCP2轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響，分別用Hcy、過表達MARS處理HEK293T細胞，收集細胞裂解液用于ChIP實驗;并以高濃度Hcy飼料飼喂C57BL/6J小鼠，取腦組織用于ChIP實驗。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果采用雙尾非配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASD患兒血液MARS轉(zhuǎn)錄水平升高 實時熒光定量PCR(圖1A)顯示，ASD組外周血cDNA中MARS水平高于對照組(P<0.01)。串聯(lián)親和純化法檢測發(fā)現(xiàn)，MeCP2是與MARS存在互作關(guān)系的轉(zhuǎn)錄因子。

2.2 Hcy自發(fā)修飾MeCP2并抑制其活性 免疫沉淀結(jié)果(圖1B)顯示，NE-4C細胞內(nèi)MeCP2能夠被Hcy自發(fā)修飾。液相質(zhì)譜(圖1C)檢測到7個可能被Hcy修飾的賴氨酸殘基位點，其中K82、K130在甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)，K271在轉(zhuǎn)錄抑制域(TRD)。

圖1 ASD患兒血液MARS轉(zhuǎn)錄水平以及Hcy自發(fā)修飾MeCP2

EMSA結(jié)果(圖2A)顯示，MeCP2發(fā)生HTL化后，其與DNA甲基化CpG結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力受到明顯抑制。

用受MeCP2轉(zhuǎn)錄調(diào)控的BDNF和GRIN2A基因的啟動子進行ChIP實驗。圖2B顯示，HEK293T細胞過表達MARS或用Hcy處理后，與MeCP2互作的靶基因啟動子均顯著減少，且共同處理有加和作用；高濃度Hcy飼料喂養(yǎng)后，小鼠腦組織MeCP2與BDNF和GRIN2A基因啟動子共沉淀顯著減少。

實時熒光定量PCR結(jié)果(圖2C)顯示，在NE-4C和HT22細胞株中，分別用不同濃度梯度Hcy處理，GRIN2A、BDNF轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對照組。

2.3 ASD患兒血液中MeCP2下游基因的轉(zhuǎn)錄水平異常 實時熒光定量PCR在對照組和ASD組各檢測了14個cDNA樣本，42.9%ASD患兒 中GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組均值；ASD患兒EAAT2、EAAT4基因平均轉(zhuǎn)錄水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在分析樣本中(n=28)GRIN2A和BDNF轉(zhuǎn)錄水平正相關(guān)(r=0.984，t=39.667)。高轉(zhuǎn)錄EAAT1～4的ASD患兒中GRIN2A、BDNF轉(zhuǎn)錄水平亦較高。

圖2 N-Hcy抑制MeCP2活性

3 討論

有研究顯示，血清高濃度Hcy可作為早期臨床診斷ASD的生物標(biāo)志物，也是葉酸依賴性甲硫氨酸循環(huán)受損的指標(biāo)[7]。Hcy在MARS的催化下錯誤編輯為HTL[8]。HTL可自發(fā)修飾到蛋白質(zhì)的高能賴氨酸殘基上，影響蛋白質(zhì)功能而致病[4]。MeCP2是作用于神經(jīng)發(fā)育基因(如BDNF、GRIN2A)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[9]，對新生兒大腦發(fā)育起重要表觀遺傳調(diào)控作用。在許多神經(jīng)發(fā)育障礙中均檢測到MeCP2基因的拷貝數(shù)變異和突變[10]。研究報道，在ASD患兒大腦皮質(zhì)中MeCP2表達水平常降低[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，高MARS表達水平和Hcy濃度使 MeCP2被HTL修飾，共價賴氨酸-Hcy化形成MeCP2-K-Hcy，被修飾的MeCP2蛋白與DNA甲基化CpG的結(jié)合活性降低，從而影響MeCP2下游神經(jīng)發(fā)育基因的轉(zhuǎn)錄水平，使GRIN2A、BDNF等的轉(zhuǎn)錄水平增加。由此認(rèn)為，MeCP2在無突變的情況下被表觀遺傳修飾的程度，即Hcy對MeCP2的修飾水平和MARS表達異?？赡苁遣糠稚窠?jīng)發(fā)育疾病(如ASD)的關(guān)鍵致病因素。

本研究從體內(nèi)修飾機制和患兒樣本檢測2方面探究高K-Hcy濃度與個體患ASD的可能聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)ASD患兒MeCP2下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控異?？赡芘cHcy對MeCP2的修飾相關(guān)，且ASD患兒血液中MARS表達水平顯著升高。此外，ASD患兒中存在一個群體，其GRIN2A、BDNF、EAATs等受MeCP2蛋白調(diào)控的靶基因為高轉(zhuǎn)錄水平，可能指向ASD中尚未分類的某種神經(jīng)發(fā)育疾病。