段袁園 金丹群 許愿愿 童文佳

耶氏肺孢子菌(PJ)又稱卡氏肺孢子菌(PC)，是肺部機(jī)會性致病菌。以往報道，PJ肺炎(PJP)常發(fā)生于人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者，尤其是外周血CD4+細(xì)胞計數(shù)<0.2×109·L-1者[1]。近年來，由于采用高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療AIDS，且隨著免疫抑制劑在器官移植、腫瘤化療和自身免疫疾病等患者中的廣泛應(yīng)用，PJP發(fā)病率在AIDS患者中顯著下降， 而在非AIDS人群中呈上升趨勢[2]。AIDS患者合并PJ感染的潛伏期約為4周，以亞急性發(fā)病為主。非AIDS患者合并PJ感染的潛伏期約為2周，病程進(jìn)展速度較快，易出現(xiàn)呼吸衰竭，病死率高[3]。目前有關(guān)成人PJP的報道較多，兒童的相關(guān)報道較少。本文回顧性分析了安徽省兒童醫(yī)院(我院)近年來收治的非HIV感染PJP患兒的臨床資料。

1 方法

1.1 PJP的診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)有發(fā)熱、氣促、咳嗽、呼吸困難、紫紺等癥狀；(2)肺部影像學(xué)檢查以磨玻璃影為主，還可表現(xiàn)為鋪路石征、肺氣囊征、支氣管血管束長索條征等；(3)以下任意1項病原學(xué)檢查陽性：①痰或支氣管肺泡灌洗液鏡檢發(fā)現(xiàn)PJ包囊，②PCR檢測PJ-DNA >103拷貝·mL-1，③肺泡灌洗液或血清標(biāo)本病原學(xué)宏基因組測序PJ陽性。

1.2 病例納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入2014年8月1日至2019年7月31日我院PICU確診PJP并接受治療的連續(xù)病例。排除滿足以下任意1項者：①HIV陽性；②臨床診斷PJP、病原學(xué)檢查陰性的病例。

1.3 資料截取 患兒的性別、年齡、基礎(chǔ)疾病，臨床癥狀和體征，實(shí)驗室檢查結(jié)果，影像學(xué)檢查資料，既往糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑的使用時間，病原學(xué)檢查結(jié)果，PJ感染相關(guān)的癥狀開始出現(xiàn)到使用甲氧芐胺嘧啶-磺胺甲基異噁唑(TMP-SMZ)的時間，隨訪情況。

需要說明的是，本文WBC、CRP、淋巴細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)截取入PICU 24 h內(nèi)的檢查結(jié)果，LDH、(1,3)-β-D-葡聚糖(BDG)截取入PICU后最高值(每周檢測2次)，PF指數(shù)截取住院期間的最差結(jié)果；對影像學(xué)原始資料進(jìn)行重新讀片。

1.4 病原學(xué)檢測 留取患兒深部痰/支氣管肺泡灌洗液，加等體積無水乙醇離心沉淀，用PBS-EDTA緩沖液重復(fù)漂洗后4 ℃保存。

1.4.1 PJ的檢測方法 六胺銀染色：采用六亞甲基四胺銀染色法(染色液購自河南賽諾特生物技術(shù)有限公司)。在油鏡下觀察，PJ包囊呈圓形、橢圓形或月牙形，囊壁染成棕色或黑褐色。若囊內(nèi)小體逸出，空囊形成括弧樣結(jié)構(gòu)，為六胺銀染色陽性。

六胺銀染色結(jié)果陰性的可疑患兒，提取標(biāo)本的基因組DNA(美國Promega公司DNA提取試劑盒)，以此為模板進(jìn)行巢式PCR(美國MBI公司Taq酶和dNTP)，擴(kuò)增后對PJP的ITS1-5.8s rDNA、ITS2基因進(jìn)行測序和基因型分析。

宏基因測序，將患兒血清或肺泡灌洗液標(biāo)本解凍，經(jīng)過幾次洗脫，抽提總DNA后用Qubit 2.0定量，illumia NextSeq測序儀測序(廣州賽哲生物科技股份有限公司)。去除低質(zhì)量測序序列后，首先比對到人類參考基因組，余序列比對到NCBI數(shù)據(jù)庫中，數(shù)據(jù)結(jié)果按照細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲進(jìn)行分類和排列。

1.4.2 其他病原體的檢測 連續(xù)2次痰液或2份不同部位的血培養(yǎng)均提示為同一細(xì)菌，定義為陽性結(jié)果；常規(guī)送檢巨細(xì)胞病毒(CMV)抗體及CMV-DNA檢測，血漿CMV-DNA≥500拷貝·mL-1，定義為CMV感染。

1.5 隨訪 入PICU后90 d時，隨訪存活患兒的肺部CT。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(最小值，最大值)表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料組間比較采用Fisher 確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間我院臨床診斷PJP 18例，其中1例HIV陽性，4例病原學(xué)檢查陰性，余13例PJP患兒進(jìn)入本文分析。 13例中，六胺銀染色鏡檢發(fā)現(xiàn)PJ包囊4例，PCR檢測PJ-DNA >103拷貝·mL-15例，宏基因測序檢出PJ 4例(3例為肺泡灌洗液標(biāo)本、1例為血清標(biāo)本)。

2.2 臨床特征 表1顯示，13例中，男7例、女6例，發(fā)病年齡(80.8±23.8)月?；A(chǔ)疾?。涸l(fā)性腎病綜合征4例，先天性免疫缺陷病和血液腫瘤各2例，實(shí)體瘤、IgA腎病、幼年型皮肌炎和免疫性血小板減少癥各1例，例5未發(fā)現(xiàn)相關(guān)基礎(chǔ)疾病(多次行淋巴細(xì)胞亞群、免疫球蛋白抗體檢測等未見異常，全外顯子基因測序未發(fā)現(xiàn)免疫缺陷相關(guān)的基因異常)。發(fā)熱12例，氣促11例、咳嗽10例(干咳8例，咳痰2例)，納差/體重減輕9例，進(jìn)行性呼吸困難8例，呻吟5例，2例肺底可聞及固定濕啰音。

10例發(fā)病前使用免疫抑制劑。本次感染相關(guān)癥狀出現(xiàn)后，均使用抗生素治療，11例同時或先后使用≥2種抗生素均無效。13例均因出現(xiàn)呼吸衰竭轉(zhuǎn)入PICU。

13例患兒中，LDH均升高，8例BDG升高。13例均在高度懷疑或確診PJP后給予TMP-SMZ治療， TMP 15～20 mg·kg-1·d-1、 SMZ 75～100 mg·kg-1·d-1，分3次靜脈輸入；8例聯(lián)合卡泊芬凈治療。4例合并CMV感染者予更昔洛韋治療，3例合并細(xì)菌感染者予相應(yīng)抗生素治療。8例患兒無創(chuàng)通氣效果欠佳，改用有創(chuàng)呼吸機(jī)輔助通氣；2例經(jīng)無創(chuàng)雙水平正壓通氣后呼吸困難好轉(zhuǎn)；2例經(jīng)鼻持續(xù)氣道正壓通氣、1例經(jīng)常規(guī)吸氧治療后，低氧血癥改善。同時針對原發(fā)病進(jìn)行治療。3例發(fā)生氣胸，其中1例(例2)給予胸腔閉式引流。

13例中6例死亡，7例存活。存活患兒住PICU時間23～65 d。

2.3 影像學(xué)表現(xiàn) 胸部X線片(圖1)顯示，13例均表現(xiàn)為雙肺透亮度下降并呈磨玻璃樣變，2例有縱隔積氣和皮下氣腫。胸部CT(圖2)顯示，13例雙肺均呈磨玻璃樣改變， 3例氣胸，2例有皮下氣腫和縱隔氣腫，1例肺氣囊改變，1例少許胸腔積液。存活的7例患兒90 d后復(fù)查胸部CT肺部滲出影基本吸收。

表1 13例非HIV感染PJP患兒的臨床特征

圖1 PJP患兒胸部X線片

圖2 PJP患兒胸部CT

2.4 存活患兒和死亡患兒的比較 表2顯示，性別構(gòu)成比、年齡、感染、免疫抑制劑應(yīng)用、氣胸、血WBC計數(shù)、LDH、BDG、CRP、CD4+細(xì)胞比例在2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。死亡患兒淋巴細(xì)胞計數(shù)(P=0.012)和氧合指數(shù)(PaO2/FIO2，P=0.027)低于存活患兒，發(fā)病至開始SMZ治療的時間長于存活患兒(P<0.038)。

3 討論

PJ通過空氣飛沫傳播，常寄生在肺泡內(nèi)， 以包囊和滋養(yǎng)體的形式存在。正常人群通過細(xì)胞免疫清除PJ，當(dāng)宿主免疫功能低下，處于潛伏期的PJ大量繁殖。非HIV免疫抑制患者的PJP較HIV患者的PJP起病急、病程進(jìn)展快，在成人中病死率為26%～64%[4-6]。PJP的預(yù)后在兒童中報道少見，一項烏干達(dá)兒童PJP預(yù)后的研究顯示，兒童病死率為40%[7]。本文13例非HIV感染的PJP患兒病死率為46.2%。Bienvenu等[6]研究中461例HIV陰性PJP患者基礎(chǔ)病以血液系統(tǒng)惡性腫瘤(39.3%)最常見，其次為癌癥(26.9%)、自身免疫性疾病(11.3%)、實(shí)體器官移植(7.4%)。本文患兒以腎病綜合征最多見，其次為先天性免疫缺陷病和血液系統(tǒng)腫瘤，與兒童和成人疾病譜系不同有關(guān)，兒童惡性腫瘤發(fā)病率較成人低，且多數(shù)先天性免疫缺陷病患兒不能存活到成年，近年來對血液腫瘤患兒常規(guī)預(yù)防性應(yīng)用TMP-SMZ，使PJP在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率明顯下降。有研究顯示，兒童腎病綜合征預(yù)防性應(yīng)用TMP-SMZ，可降低PJP的發(fā)病率[8]，但目前僅局限于單中心、小樣本的研究。

表2 存活患兒和死亡患兒的臨床資料比較 [n(%)]

HIV陰性PJP患者的臨床表現(xiàn)主要為胸悶、干咳、發(fā)熱，隨著病程迅速進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)氣促和進(jìn)行性加重的呼吸困難，伴嚴(yán)重的氧合障礙、彌漫性肺泡損傷。體征和肺部嚴(yán)重程度不一致是該病的典型臨床表現(xiàn)。本文13例HIV陰性PJP患兒的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、氣促和咳嗽，小嬰兒可表現(xiàn)為呻吟，肺部聽診11例無啰音，呈現(xiàn)癥狀與體征分離的表現(xiàn)。土耳其的一項研究[9]顯示，PJP合并急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是影響預(yù)后的獨(dú)立危險因素，本文中死亡患兒PaO2/FIO2較存活患兒低，與該文獻(xiàn)結(jié)果一致。

血清學(xué)檢查簡便且創(chuàng)傷小，研究者一直試圖通過血液學(xué)檢查實(shí)現(xiàn)PJP的診斷。BDG為PJ細(xì)胞壁的組成成分之一，能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)。一項Meta分析[10]結(jié)果顯示，血清BDG在HIV陽性和HIV陰性的PJP患者中的敏感度分別為92%和85%，并提出通過檢測BDG可基本排除HIV陽性病例中的PJ感染，但對于HIV陰性者有假陰性的可能，需結(jié)合臨床癥狀和影像學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析。有研究報道LDH升高診斷PJP的敏感度可達(dá)100%，但其特異度僅為47%[11]。鄧春濤等[12]認(rèn)為，LDH對診斷PJP有一定價值，尤其是AIDS患者。另有研究指出，將BDG和LDH聯(lián)合用于PJP診斷時，診斷界值BDG為400 pg·mL-1、LDH為350 U·L-1時，特異度達(dá)83.9%[13]。本文13例患兒中，LDH均升高，8例BDG升高，但存活患兒和死亡患兒間LDH和BDG差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示LDH和BDG可能與預(yù)后無關(guān)。

PJ除可造成肺機(jī)械性損傷外，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞膜受損，從而引起肺泡和肺間質(zhì)改變[6,14]，這是PJP發(fā)病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。影像學(xué)檢查對于PJP的診斷極其重要，早期胸部X線檢查無明顯改變，隨著病程進(jìn)展，出現(xiàn)雙側(cè)、彌漫性、對稱性小顆粒狀或網(wǎng)狀滲出影的典型表現(xiàn)，病灶主要分布于肺門周和下肺野[15]。PJP患者CT通常表現(xiàn)為鋪路石征、磨玻璃征、肺氣囊征、月牙征、支氣管血管束長索條征以及混合型，以磨玻璃征最常見[16]。本文13例病例均出現(xiàn)磨玻璃樣改變，3例有氣胸、縱隔積氣。

有文獻(xiàn)[17]報道，非AIDS的PJP患者，如影像學(xué)表現(xiàn)有氣胸、縱隔氣腫和皮下氣腫，提示預(yù)后不良。本文中死亡患兒淋巴細(xì)胞計數(shù)和PaO2/FIO2低于存活患兒，發(fā)病至開始SMZ治療的時間長于存活患兒，與成人報道[18-20]一致，但是否發(fā)生氣胸、是否合并其他感染在本文死亡和存活患兒間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，當(dāng)免疫功能低下的患兒出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、氣促、干咳、進(jìn)行性加重的呼吸困難，肺部CT檢查提示雙肺磨玻璃樣變，需考慮PJP可能，一旦磨玻璃區(qū)內(nèi)出現(xiàn)肺氣囊或氣胸應(yīng)高度懷疑，及早進(jìn)行病原學(xué)檢查。當(dāng)高危患兒出現(xiàn)可疑癥狀時，應(yīng)立即經(jīng)驗性給予TMP-SMZ治療，不必等待病原學(xué)結(jié)果，以免延誤病情。