張付遠(yuǎn) 李丹丹 宋墩福

(江西環(huán)境工程職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)，是蘭科花葉開唇蘭屬的多年生草本藥用植物，可全草入藥，具有增強(qiáng)人體免疫及抗衰老的作用，在治療高血壓、糖尿病、癌癥和腫瘤等方面具有顯著藥用價(jià)值[1]。

金線蓮為典型的陰生藥用植物，喜陰涼、潮濕環(huán)境，對生長環(huán)境要求較嚴(yán)苛。野生環(huán)境下，金線蓮種子發(fā)芽率低，需從枝真菌根真菌侵入將種子胚細(xì)胞中的淀粉轉(zhuǎn)化為糖才可促使種子萌發(fā)生長[2,3]，而以分根法或扦插方式繁殖所需時(shí)間長。野生金線蓮由于人為采摘，導(dǎo)致其生存環(huán)境惡劣，現(xiàn)已瀕臨滅絕，因此發(fā)展金線蓮人工育苗，實(shí)現(xiàn)其種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)勢在必行。目前，有很多研究者對金線蓮組培過程中不同培養(yǎng)基、外植體、取材部位及添加物等對金線蓮組織培養(yǎng)的影響進(jìn)行研究。但組培也存在污染率高、流程繁多、周期長、成本高等問題[4]。天然更新，是利用植物自身繁殖能力形成新一代的過程[5]。通過天然更新技術(shù)獲得植株的方法，具有節(jié)省種苗、降低栽培成本等優(yōu)勢。

目前關(guān)于金線蓮天然更新技術(shù)的研究還未見報(bào)道。本研究選擇江西本土瀕危中草藥金線蓮為研究對象，通過對其成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，多糖、黃酮和氨基酸等為其最重要的營養(yǎng)和藥用成分[6]。隨著金線蓮經(jīng)濟(jì)價(jià)值日益增加，加之野生資源過度采挖，造成資源短缺，形成惡性循環(huán)。因此，金線蓮人工種植受到越來越多關(guān)注[7,8]，但人工種植中種苗成本占據(jù)絕大部分，因此尋求適宜的方式降低種苗成本是目前金線蓮產(chǎn)業(yè)的主要問題。本研究通過對種植6個(gè)月組培苗，剪去地上部分留地下根部進(jìn)行天然更新的方式，研究不同種植時(shí)間藥用成分變化，以期了解金線蓮天然更新的可能性，為金線蓮植被恢復(fù)、生物多樣性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)降低金線蓮生產(chǎn)成本，旨在為金線蓮資源保護(hù)、開發(fā)利用及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 種植材料

供試金線蓮品種“江西金線蓮”，無菌繁殖苗由江西環(huán)境工程職業(yè)學(xué)院提供。于2017年10月1日，選取生長周期為5個(gè)月、形態(tài)一致的組培苗200瓶，每瓶約30株。在種植基地大棚內(nèi)煉苗30d，使組培苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境。將組培苗取出，用清水洗凈根部，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%KMnO4溶液對根部及扦插部位進(jìn)行消毒處理。

1.2 研究地概況

研究時(shí)間為2018年3月—2019年5月，種植地點(diǎn)為在江西省贛州市信豐縣金盆山林場，地理位置坐標(biāo)大致為E114°93′，N25°38′。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)3m2，設(shè)置組培苗直接種植和人工促進(jìn)更新2種方式。種植密度為10cm×10cm，100株·m-2。灌水方式為人工噴灑，水源為地山泉水，各處理基施進(jìn)口草炭0.4m3·3m-2。選擇陰涼、潮濕、通風(fēng)的林下，整理寬1m、長4m的苗床，苗床起壟高度30cm，苗床最好有一定坡度，一頭高一頭低便于排水。插穗處理，用75%酒精消毒的剪刀修剪插穗，而后用800倍液多菌靈消毒，消毒后置于陰涼處4h。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 多糖含量測定

參照陶子曦[9]的方法進(jìn)行。

1.4.1.1 供試材料及樣品處理

瓶苗直接種植和對種植6個(gè)月的金線蓮剪去地上部分人工促進(jìn)更新，兩者的生長時(shí)間均為6個(gè)月。取地上部分植株，洗凈后裝于牛皮袋中，而后放入烘箱105℃殺青15～20min，45℃烘干至恒重。使用JXFSTPRP-24全自動(dòng)樣品快速研磨儀粉碎(60Hz，30s)，粉末裝于密封袋中置于干燥皿中保存。

1.4.1.2 供試儀器

EYELA N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)；SHZ-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵(西安波意爾精密儀器有限公司)；98-1-B型智能恒溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；WSTO-1型遠(yuǎn)紅外快速干燥器(鄭州杜甫儀器廠)；UV-6100PCS型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；AB135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))；WF-4000C型常壓微波快速反應(yīng)系統(tǒng)(上海屹堯分析儀器有限公司)。

1.4.1.3 多糖樣品的制備

稱取金線蓮粉末0.2g(精確到0.0001)，加80%乙醇4mL浸泡過夜，8000rpm離心10min后棄上清液留沉淀，加入4mL蒸餾水超聲提取(40℃，30min)，重復(fù)3次，收集3次離心后的上清液于一管中，置于冷凍真空干燥機(jī)中將溶液體積濃縮至2mL，不足2mL的用蒸餾水補(bǔ)足。加入無水乙醇使其含量達(dá)到80%，在4℃冰箱中放置過夜使多糖沉淀析出。使用高速離心機(jī)8000rpm×15min離心，得到多糖沉淀。使用無水乙醇洗滌沉淀2～3遍，以去除雜質(zhì)，將乙醇揮發(fā)至干，蒸餾水溶解沉淀后容量瓶定容，即得多糖樣品待測液。

1.4.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20mg，加水定容至100mL，得0.2mg·mL-1的葡萄糖母液，加水稀釋成一系列梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次加入6%苯酚溶液1mL，濃硫酸5mL，搖勻后靜置5min，置沸水中水浴15min，冷卻至室溫后在490nm處測定吸光度，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.1.5 多糖樣品的測定

取上述制得的多糖樣品溶液1mL，加入1mL的蒸餾水，按照文中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的顯色方法，在490nm處測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算得樣品中多糖含量。

1.4.2 總黃酮含量測定

參照李丹丹等[10]方法進(jìn)行。

1.4.2.1 供試材料、樣品處理及供試儀器同1.3.1。

1.4.2.2 樣品溶液制備

分別精密稱取金線蓮組培葉與全株粉末1.0000g，置于微波提取灌中，加95%乙醇50mL，調(diào)節(jié)溫度為80℃，功率為600W，提取30min，提取2次，合并濾液，轉(zhuǎn)移至小燒瓶，水浴加熱至燒瓶內(nèi)的液體少于100mL，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，加95%乙醇定容至刻度。

1.4.2.3 對照品溶液制備

精密稱取蘆丁對照品10.00mg，置于100mL容量瓶中，用95%乙醇溶解定容，配成0.1mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL蘆丁對照品至10mL具塞試管中，先加入5%亞硝酸鈉溶液0.6mL，搖勻。放置6min，加10%亞硝酸鋁溶液0.6mL，搖勻；放置6min，加入4%的氫氧化鈉溶液3mL，再用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。以第1支試管做空白，在500nm波長處測吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C(ug·mL-1)為橫坐標(biāo)，求得回歸方程A=0.0113C-0.0233，R2=0.9948。在0.00～0.05mg·mL-1的范圍內(nèi)，濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

1.4.2.5 樣品總黃酮含量測定

取各樣品1mL置10mL具塞試管中，再分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.6mL，搖勻；放置6min，加入10%硝酸鋁溶液0.6mL，搖勻；放置6min，加入4%NaOH溶液3mL，再用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻；放置15min，以蘆丁為對照品，在500nm下測定其吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010、Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及做圖分析，采用DPS V7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，在完全隨機(jī)設(shè)計(jì)下采取單因素實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析中LSD多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量的動(dòng)態(tài)變化

金線蓮中的多糖是抑制糖尿病血管病變的物質(zhì)，是金線蓮中治療有關(guān)糖尿病的重要活性化合物[11]。從表1可知，人工更新方式金線蓮多糖含量高于金線蓮組培苗直接種植方式，取樣的每個(gè)月，多糖含量是組培苗直接種植1.1～1.7倍；就種植時(shí)間變化分析認(rèn)為，隨著種植時(shí)間的延長，其多糖含量逐漸增加，在種植1～4個(gè)月，總黃酮含量達(dá)到差異水平(P﹤0.01)，但在種植5個(gè)月和6個(gè)月后，其黃酮含量雖有增加，但未達(dá)到差異水平，2種種植方式趨勢一致，可能是由于金線蓮經(jīng)過長時(shí)間生長后，可溶性多糖轉(zhuǎn)化為纖維素等非可溶性多糖。由此可見，種植4個(gè)月以上金線蓮可獲得較高的多糖，這為金線蓮的采收提供科學(xué)依據(jù)。

表1 試驗(yàn)處理

表2 金線蓮直接種植和人工更新后多糖含量動(dòng)態(tài)變化

2.2 總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化

黃酮是次級代謝產(chǎn)物中的一種，產(chǎn)生于植物生長發(fā)育的過程中。金線蓮中主要的黃酮化合物有蘆丁、槲皮素、山奈酚等，具有抗氧化性，可以降血糖、降固醇、促進(jìn)傷口愈合等[12]。2種方式金線蓮葉片中黃酮含量的變化見表3。結(jié)果顯示：直接種植和留地下部分萌芽更新方式，金線蓮葉片中總黃酮含量均隨處理時(shí)間的延長，總黃酮含量呈上升趨勢，萌新6個(gè)月與其它月份達(dá)到顯著差(P<0.01)。而種植6個(gè)月后萌新與組培苗直接種植相比，取樣的每個(gè)月，總黃酮含量是組培苗直接種植1.2～1.3倍。隨著種植時(shí)間增加，金線蓮藥用成分的含量也在增加，這與之前很多研究結(jié)果相一致[7]。

表3 金線蓮直接種植和人工更新后總黃酮含量動(dòng)態(tài)變化

3 結(jié)論與討論

植苗造林及更新是在造林中比較常用的方法，該方法是將將植株直接種植[13]，等生長到一定程度后砍伐，撫育讓其自然更新，可減少人力、物力等的消耗，并能有較高的成活率。而作為林下經(jīng)濟(jì)植物的金線蓮，其種苗費(fèi)用在整個(gè)種植成本中占比較大，通過人工更新模擬野生金線蓮繁殖方式是值得探索的途徑。因此，本研究對不同更新技術(shù)對金線蓮品質(zhì)的影響進(jìn)行研究。

綜上可知，不同土質(zhì)、不同栽培時(shí)間，金線蓮中多糖和黃酮成分變化較大。人工促進(jìn)金線蓮天然更新方式中金線蓮葉片中多糖和黃酮含量顯著高于組培苗直接種植方式，且在栽培5～6月時(shí)藥用價(jià)值含量增加緩慢，這對栽培和采收金線蓮具有重要指導(dǎo)意義。