王萌，魏健，王云鵬

（1.長(zhǎng)春師范大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130032；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130033）

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21能夠刺激脂肪細(xì)胞的葡萄糖吸收，降低血漿中葡萄糖和甘油三醋的濃度，從而糾正多種代謝異常。并且FGF21是FGF家族中發(fā)現(xiàn)的唯一沒(méi)有促有絲分裂活性的基因，因此大大降低了其臨床用藥的風(fēng)險(xiǎn)，被認(rèn)為是一種潛在的治療代謝性疾病的新藥。尤其是FGF21與胰島素相比，F(xiàn)GF21具有過(guò)量不導(dǎo)致低血糖的優(yōu)點(diǎn)。另外FGF21不具備FGF家族經(jīng)典的促有絲分裂活性，徹底消除了人們對(duì)于FGF21致瘤性的擔(dān)憂，使得FGF21體內(nèi)用藥治療糖尿病成為可能。FGF21不僅能通過(guò)調(diào)節(jié)糖脂代謝有效抑制糖尿病的發(fā)展，針對(duì)于多種糖尿病并發(fā)癥也表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。由于FGF21作為一種藥用蛋白的獲得途徑十分有限，且價(jià)格昂貴，因此而限制了FGF21的臨床研究。

1 FGF21的原核表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌被廣泛地應(yīng)用到重組蛋白的生產(chǎn)有生產(chǎn)成本低、操作技術(shù)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是表達(dá)非糖基化重組蛋白的首選，目前FDA批準(zhǔn)生產(chǎn)的重組蛋白藥物大約有30%由大腸桿菌表達(dá)[1]。然而，大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白，具有易被蛋白酶降解、不能形成正確的二硫鍵和錯(cuò)誤折疊等風(fēng)險(xiǎn)，而導(dǎo)致重組蛋白不表達(dá)、表達(dá)量低以及錯(cuò)誤折疊形成包涵體等問(wèn)題[2]。相對(duì)于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞周質(zhì)是一個(gè)氧化環(huán)境，有利于二硫鍵的正確形成促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊；此外細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶含量低，重組蛋白不易被降解；同時(shí)細(xì)胞周質(zhì)蛋白總量低，便于重組蛋白的提取純化，簡(jiǎn)化了提純工藝并節(jié)約了生產(chǎn)成本[3]。Sec分泌途徑是大腸桿菌經(jīng)典的依賴于N 端信號(hào)肽的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，已有許多重組蛋白通過(guò)Sec分泌途徑成功表達(dá)。利用大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)周質(zhì)已經(jīng)制備出純度在95%以上且具有生物活性的FGF21蛋白。

2 FGF21的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，首先畢赤酵母培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，適合高密度培養(yǎng)，提高目的蛋白的產(chǎn)量；其次利用甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶Ⅰ啟動(dòng)子，嚴(yán)格控制外源基因的表達(dá)，無(wú)論是胞內(nèi)、胞外均可實(shí)現(xiàn)外源基因的高表達(dá)。DNA轉(zhuǎn)化率高，擁有真核蛋白修飾系統(tǒng)，如糖基化、二硫鍵的形成及蛋白酶解加工，并且畢赤酵母自身分泌蛋白水平較低，表達(dá)的外源蛋白易于分離純化[4]，尤其適用表達(dá)外源蛋白。邵明龍等[5]利用畢赤酵母中表達(dá)FGF21，獲得蛋白純度達(dá)90%。但在已完成的表達(dá)過(guò)程中存在表達(dá)量較低，且蛋白穩(wěn)定性差，易降解，無(wú)法獲得具有完整結(jié)構(gòu)的FGF21等問(wèn)題

3 FGF21的油體表達(dá)系統(tǒng)

植物油體表達(dá)系統(tǒng)具有完整的真核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)糖基化、酰基化、磷酸化等翻譯后加工過(guò)程，可使其表達(dá)產(chǎn)物具有與高等動(dòng)物細(xì)胞一致的生物活性。同時(shí)，植物油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白利用油體親脂疏水的特性，使轉(zhuǎn)基因植物種子經(jīng)過(guò)“粉碎－液體抽提－離心”處理，將融合蛋白從轉(zhuǎn)基因植物種子中分離出來(lái)[6]大大簡(jiǎn)化了目標(biāo)蛋白與受體內(nèi)源蛋白的分離和純化工藝，降低了純化成本。目前，已有成功利用油體表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的先例。

油體表達(dá)系統(tǒng)是基于降低某些植物表達(dá)蛋白的提取、純化成本而研制的一種新的植物表達(dá)體系，其具有以下特點(diǎn)：首先油體基因的表達(dá)受激素和發(fā)育的調(diào)控，使油體基因只在種子成熟過(guò)程中表達(dá)，因此通過(guò)外源基因與油體基因進(jìn)行融合，可以使目的基因在植物的種子中特異表達(dá)；其次油體基因的轉(zhuǎn)錄在開(kāi)花后4～6周，成熟種子中的mRNA急劇降低，因此油體蛋白可在成熟種子中穩(wěn)定存在。目前利用油體表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功地表達(dá)了人胰島素[7]、木聚糖酶等蛋白。本研究的蛋白檢測(cè)結(jié)果可以進(jìn)一步證明利用油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的可行性。目前，F(xiàn)GF21在微生物中的表達(dá)量雖然較高，但一般呈包涵體形式表達(dá)，純化及復(fù)性成本較高，而且活性不高[8]。FGF21在油菜油體中的表達(dá)，增強(qiáng)了其穩(wěn)定性，這將為藥用蛋白FGF21研究奠定基礎(chǔ)。

付宏岐等人初步建立了以PMI為安全篩選標(biāo)記的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化體系，成功獲得了表達(dá)FGF21蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系[9]，并收獲了T1代擬南芥種子；PCR擴(kuò)增和Southern blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，重組FGF21基因以單拷貝和多拷貝2種方式插入到轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組中；BandScand 5.0軟件和West-ern blot分析檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21融合蛋白約占轉(zhuǎn)基因擬南芥種子可溶性蛋白的3.76%，并具有良好的免疫原性。

植物生物反應(yīng)器與其他生物反應(yīng)器如動(dòng)物反應(yīng)器、蛋白的原核表達(dá)等相比有許多明顯的優(yōu)勢(shì)，如低成本、安全、操作簡(jiǎn)單、蛋白能正確折疊及得到真核相關(guān)修飾等，已被廣泛研究并應(yīng)用在藥物蛋白的生產(chǎn)上。目前，已有成功利用番茄穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的先例，如張麗華等[10]利用櫻桃番茄成功遺傳轉(zhuǎn)化了胸腺肽基因。近些年來(lái)，隨著基因工程等生物技術(shù)的不斷發(fā)展，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的植物基因工程技術(shù)，為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了強(qiáng)有力的支持，已有幾十種藥用蛋白或多肽在植物中成功表達(dá)[11]。

李海燕等人將FGF21基因轉(zhuǎn)入番茄中[14]，以番茄為生物反應(yīng)器生產(chǎn)FGF21蛋白，旨在為進(jìn)一步提高番茄的利用價(jià)值及為利用其他植物生物反應(yīng)器表達(dá)FGF21蛋白提供理論參考。