王艷 王淼 劉菊才 吳艷云 徐藝芮 羅培林

摘要 ? ?建立了雞蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取、液液分配和MCX固相萃取柱凈化富集后UPLC-MS/MS檢測(cè)，以乙腈和水（0.1%甲酸）為流動(dòng)相，經(jīng)C18（2.1×50 mm，1.8 μm）色譜柱分離后，在正離子模式下采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，甲硝唑、甲硝唑代謝物產(chǎn)物羥基甲硝唑、地美硝唑、地美硝唑代謝產(chǎn)物羥甲基甲硝咪唑在1.0～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.997 5，在1.0、5.0、20.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平均回收率為68.1%～92.3%，RSD為3.4%～9.0%，方法檢出限為0.1 μg/kg。該方法靈敏性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性好，適用于雞蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留的定性和定量分析，為雞蛋中硝基咪唑類藥物檢測(cè)提供一定的技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞 ? ?甲硝唑;地美硝唑;代謝物;雞蛋;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào) ? ?O657.63;TS251.55 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2020）22-0191-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

甲硝唑、地美硝唑是人工合成硝基咪唑類藥物，對(duì)腸道和組織的厭氧菌感染、家禽的滴蟲病感染、雞生殖系統(tǒng)疾病等療效好[1]，因而常被添加于飼料中，用于改善飼料轉(zhuǎn)化率[2]。硝基雜環(huán)類化合物是引起細(xì)胞誘變的物質(zhì)，硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物具有潛在的動(dòng)物致癌、致畸、誘變和遺傳毒性作用[3]，其殘留對(duì)動(dòng)物性食品構(gòu)成了威脅。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定甲硝唑、地美硝唑允許作治療用獸藥，但不得在動(dòng)物性食品中檢出[4]。日本規(guī)定甲硝唑、地美硝唑在食品中不得檢出，歐盟和美國(guó)均規(guī)定了甲硝唑、地美硝唑?yàn)榻毛F藥[5-6]。

我國(guó)已制定了一些針對(duì)硝基咪唑類藥物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但鮮見雞蛋中硝基咪唑類藥物的檢測(cè)?，F(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)研究的基質(zhì)多集中在畜禽類組織、飼料、蜂蜜等方面，對(duì)雞蛋中硝基咪唑類藥物多組分殘留及代謝物研究甚少。本試驗(yàn)針對(duì)雞蛋的基質(zhì)特點(diǎn)，對(duì)樣品提取、凈化條件進(jìn)行優(yōu)化，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了雞蛋中甲硝唑（Metronidazole MNZ）、地美硝唑（Dimetridazole DMZ）、甲硝唑代謝產(chǎn)物羥基甲硝唑（Metronidazole-OH MNZOH）、地美硝唑代謝產(chǎn)物羥甲基甲硝咪唑（2-Hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-1H-imidazole HMMNI）殘留同時(shí)檢測(cè)的方法。該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，適合大批量樣品檢測(cè)。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?儀器與設(shè)備

1290-6460高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司;Milli-Q超純水儀，美國(guó)密理博公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司;高速離心機(jī)，湖南湘儀公司;氮吹儀。

1.2 ? ?材料與試劑

甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純，F(xiàn)isher公司;其他試劑均為分析純?cè)噭?試驗(yàn)用水為超純水;Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL），美國(guó)Waters公司。

1.3 ? ?試驗(yàn)方法

1.3.1 ? ?溶液配制。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：吸取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃下保存。標(biāo)準(zhǔn)中間使用液的配制：吸取10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃下保存。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間使用液，用空白樣品提取液配制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 ? ?樣品制備。雞蛋去殼，放入容器，用勻漿機(jī)將樣品攪拌混勻，裝入潔凈樣品盒中，-20 ℃以下保存，試驗(yàn)前解凍混勻稱樣。

1.3.3 ? ?提取。稱取2.0 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL塑料離心管中，加入15 mL乙酸乙酯2 500 r/min渦動(dòng)5 min，6 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，殘?jiān)儆?0 mL乙酸乙酯提取1次，合并2次提取液，35 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)濃縮至干后加入0.1 mol/L鹽酸溶液，充分溶解殘?jiān)?，再加? mL正己烷，充分混勻，轉(zhuǎn)移至15mL塑料離心管中，6 000 r/min離心5 min，去除上層正己烷層，下層備用。

1.3.4 ? ?凈化。MCX固相萃取柱使用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液活化平衡后，加入備用液，然后依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、3 mL甲醇、3 mL 2%氨水-甲醇（9∶1，體積比）淋洗并擠干，5%氨水-甲醇（2∶3，體積比）3 mL洗脫，洗脫液于35 ℃氮?dú)獯抵? mL以下，0.1 mol/L甲酸溶液-乙腈（9∶1，體積比）定容至1.0 mL，混勻后過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，供LC-MS/MS檢測(cè)。

1.3.5 ? ?儀器條件。色譜條件：色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18（Rapid Resolution HD 2.1×50 mm，1.8 μm）;流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量2 μL;流動(dòng)相A為水（0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：離子源AJS-ESI;毛細(xì)管電壓4 000 V;霧化氣壓力0.31 MPa;干燥氣溫度300 ℃;干燥氣流量5 L/min;鞘氣流量11 L/min;鞘氣溫度250 ℃;噴嘴電壓0 V;離子極性正;質(zhì)量掃描模式MRM。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?質(zhì)譜條件優(yōu)化

選擇ESI（+）的電離模式下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，確定各目標(biāo)物的分子離子峰，均為[M+H]+型。以分子離子峰作為母離子作二級(jí)質(zhì)譜掃描，并進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，選取離子豐度較高、干擾小的2個(gè)碎片離子作為目標(biāo)物的定性和定量離子。甲硝唑、地美硝唑及其代謝物的母離子、定性和定量離子及碰撞能見表2。標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子流圖見圖1。

2.2 ? ?提取方法的選擇

甲硝唑在水中微溶，而地美硝唑不溶于水但能溶于稀酸，在乙腈和乙酸乙酯中溶解性均較好。試驗(yàn)選取乙酸乙酯和乙腈為提取溶劑并進(jìn)行比較。結(jié)果表明，乙腈沉淀蛋白作用良好，能形成致密的蛋白質(zhì)沉淀，但提取雜質(zhì)多，提取液旋蒸濃縮時(shí)間長(zhǎng)，0.1 moL/L鹽酸溶液溶解殘?jiān)鼤r(shí)雜質(zhì)易析出，且極易堵塞凈化柱。從5 μg/kg的添加回收效果來(lái)看，乙腈作為提取溶劑時(shí)對(duì)甲硝唑和地美硝唑的回收率低于70%，對(duì)羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的回收率不足50%。而乙酸乙酯作提取溶劑時(shí)，提取雜質(zhì)較少，旋蒸濃縮過(guò)程平穩(wěn)、時(shí)間短，并有利于正己烷脫脂，對(duì)各目標(biāo)物回收效果均理想。因此，選提取效率高的乙酸乙酯作提取溶劑。

2.3 ? ?固相萃取小柱的選擇

試驗(yàn)考察了Oasis HLB、Oasis MCX、Agela Cleanert SCX、Agela Cleanert PCX 4種萃取小柱對(duì)各目標(biāo)物的回收率（添加量為5 μg/kg）差異。結(jié)果表明，MCX、PCX、SCX萃取柱對(duì)甲硝唑、地美硝唑、羥甲基甲硝咪唑回收良好，回收率無(wú)顯著差異，但MCX萃取柱對(duì)羥基甲硝唑的回收率優(yōu)于PCX、SCX萃取柱，而HLB萃取柱對(duì)4種化合物回收率均偏低。因此，選用MCX萃取小柱為凈化柱（圖2）。

2.4 ? ?線性范圍、線性方程與檢出限

以空白基質(zhì)液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法評(píng)價(jià)方法的檢出限。標(biāo)準(zhǔn)曲線的系列質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100 ng/mL，以目標(biāo)化合物定量離子峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表3），相關(guān)系數(shù)均大于0.997 5。當(dāng)空白樣品標(biāo)準(zhǔn)添加水平為0.1 μg/kg時(shí)，各化合物的信噪比（S/N）均大于3，故將各藥物方法檢出限定為0.1 μg/kg。

2.5 ? ?準(zhǔn)確度和精密度

利用陰性雞蛋樣品通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn)考察方法的回收率以及精密度。分別在1.0、5.0、20.0 μg/kg 3個(gè)水平添加各成分，按照試驗(yàn)方法測(cè)定回收率，每個(gè)水平做6個(gè)平行性試驗(yàn)，計(jì)算平行回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，羥基甲硝唑的平均回收率為68.1%～72.0%，甲硝唑、地美硝唑、羥甲基甲硝咪唑的平均回收率為79.1%～92.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～9.0%，方法準(zhǔn)確度和精密度滿足藥物殘留檢測(cè)的要求。

3 ? ?結(jié)論

本文采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立雞蛋中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留同時(shí)檢測(cè)的分析方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取、MCX固相萃取柱凈化富集后UPLC-MS/MS檢測(cè)，該法操作方便、對(duì)雞蛋基質(zhì)凈化效果好、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、精密度良好，可實(shí)現(xiàn)雞蛋樣品中硝基咪唑類藥物的分析確證。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

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