馬少梅

摘要 ? ?本文以北海道黃楊莖段為材料，探討了不同消毒時(shí)間、不同激素濃度配比對(duì)北海道黃楊再生體系建立的影響。結(jié)果表明，北海道黃楊莖段外植體最佳消毒時(shí)間為0.1%升汞處理8 min，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

關(guān)鍵詞 ? ?北海道黃楊;外植體;莖段;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) ? ?S792.11 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2020）22-0109-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract ? ?This paper used the stems of Euonymus japonicu as the materials， explored the effects of different disinfection times and hormone concentration on the establishment of regeneration system. The results showed that the best disinfection effect of the explants of Euonymus japonicus was achieved by 0.1% HgCl2 for 8 minutes，and the optimal induction medium was MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L.

Keywords ? ?Euonymus japonica; explant; stem; tissue culture

北海道黃楊（Euonymus japonicus）是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬常綠闊葉樹種，具有極強(qiáng)的耐寒特性，能耐-23.9 ℃低溫，是我國(guó)華北地區(qū)抗寒性最好的常綠闊葉喬木[1-2]。北海道黃楊組織培養(yǎng)的成功，為短時(shí)間內(nèi)快繁苗木以滿足市場(chǎng)需求提供了技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)也可為今后研究這一樹種的植株再生及外源基因?qū)?，培育抗寒、抗旱新品種提供參考。探索北海道黃楊再生體系的建立，以期為今后做好遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定基礎(chǔ)。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?外植體選擇

將采集的北海道黃楊枝條用自來水和軟毛刷洗刷干凈，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸泡10 s，再用0.1%升汞溶液振蕩消毒（設(shè)10、8、6 min等3個(gè)消毒處理），最后用無菌水沖洗5～6次，保證材料表面消毒液沖洗干凈，用消毒濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將消毒后的外植體切成0.8～1.0 cm的小塊，接種到相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)[3-4]。

1.2 ? ?培養(yǎng)基及配方

本次試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基（瓊脂4 g/L、蔗糖25 g/L、pH值5.7），配好的培養(yǎng)基用121 ℃的蒸汽高壓滅菌鍋滅菌20～25 min，待培養(yǎng)基在室溫凝固后即可使用[5]。

1.3 ? ?莖段愈傷組織誘導(dǎo)

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MS）中按照不同的配比加入不同濃度的2，4-D（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L），比較不同激素濃度對(duì)北海道黃楊莖段愈傷組織誘導(dǎo)的情況，從而篩選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.4 ? ?培養(yǎng)條件

外植體培養(yǎng)條件為室內(nèi)溫度20～25 ℃，光照時(shí)間每天10～12 h，光照強(qiáng)度1 000～1 200 lx。同時(shí)，做好培養(yǎng)室的消毒工作，以免因外界環(huán)境消毒不徹底，增加外植體污染概率[6-7]。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?不同消毒時(shí)間對(duì)外植體滅菌成活率的影響

北海道黃楊外植體經(jīng)滅菌后接種在相應(yīng)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)2周后調(diào)查其成活率。結(jié)果表明：北海道黃楊外植體用0.1%升汞處理10 min，莖段污染率最低（5%），莖段誘導(dǎo)成活率為40%;外植體用0.1%升汞處理8 min，莖段污染率為10%，成活率最高（70%）;外植體用0.1%升汞處理6 min，莖段污染率為40%，成活率為30%（表1）。通過試驗(yàn)對(duì)比，北海道黃楊外植體的最佳消毒時(shí)間為8 min，此時(shí)外植體污染率較少，植株成活率最高。如果消毒時(shí)間過短，植株容易受到污染;消毒時(shí)間過長(zhǎng)，植株極易被消毒液殺死。

2.2 ? ?不同激素濃度對(duì)莖段誘導(dǎo)愈傷組織的影響

將經(jīng)過消毒的北海道黃楊外植體切成0.8～1.0 cm長(zhǎng)的切段，接種于莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，相同濃度的6-BA和2，4-D對(duì)北海道黃楊莖段愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。相同濃度6-BA對(duì)北海道黃楊外植體誘導(dǎo)效果不如2，4-D，相同濃度的6-BA對(duì)愈傷組織的啟動(dòng)時(shí)間比2，4-D晚，相同時(shí)間誘導(dǎo)率也沒有2，4-D高。同時(shí)，隨著細(xì)胞分裂素6-BA和2，4-D濃度的提高，莖段愈傷組織啟動(dòng)時(shí)間越早，愈傷組織的形成率也越高，但并不是激素濃度越大越有利于愈傷組織和不定芽的形成。如表2所示，2，4-D濃度越大，其誘導(dǎo)的愈傷組織褐化情況越嚴(yán)重，形成的愈傷組織質(zhì)量越差，越不利于芽的誘導(dǎo)。在相同的細(xì)胞分裂素條件下，添加不同濃度的生長(zhǎng)素，北海道黃楊外植體芽誘導(dǎo)情況也不同，生長(zhǎng)素濃度越高，不定芽死亡率也越高。由此可知，MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是莖段誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基。

2.3 ? ?北海道黃楊再生植株的分化培養(yǎng)

將已經(jīng)誘導(dǎo)成功的不定芽接種到相應(yīng)的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行試管苗的分化培養(yǎng)，相應(yīng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，培養(yǎng)20 d左右，在芽基部逐漸開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，30 d左右便有鮮嫩的植株形成，芽的分化系數(shù)約為4。

2.4 ? ?再生植株的生根及移栽

將經(jīng)過復(fù)壯培養(yǎng)的北海道黃楊試管苗接種到相應(yīng)的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，約20 d植株基部便有非常茁壯的不定根生成，待生根率達(dá)到70%左右、植株具有2條以上根系、根長(zhǎng)達(dá)1 cm時(shí)，即可將組培苗轉(zhuǎn)移到干凈、通風(fēng)良好的溫室內(nèi)進(jìn)行煉苗培養(yǎng)，1周后用小鑷子取出小苗，洗凈根上的瓊脂，栽植于配比為蛭石∶珍珠巖=3∶1的基質(zhì)上進(jìn)行培養(yǎng)。試管苗是否能夠移栽成功，除要求試管苗生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)育完整、根的維管束與莖相連之外，移栽后的養(yǎng)護(hù)管理也是非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。試管苗移栽后的養(yǎng)護(hù)管理主要應(yīng)注意以下幾個(gè)方面，即保持小苗的水分供需平衡、防止菌類滋生、保持一定的光溫條件、保持基質(zhì)適當(dāng)?shù)耐庑?、防止風(fēng)雨的影響等?？偠灾褪窃诠?、溫、水、氣、肥各方面對(duì)小苗的整體生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行調(diào)控[8-9]，以保證其生長(zhǎng)健壯。

3 ? ?結(jié)論與討論

（1）利用北海道黃楊的莖段作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，既可以進(jìn)行快速繁殖，又可以保持植株遺傳性狀的穩(wěn)定性。

（2）北海道黃楊的外植體在75%乙醇消毒的基礎(chǔ)上，再用0.1%升汞進(jìn)行8 min消毒處理，外植體污染率較低，成活率較高，是最佳的消毒處理時(shí)間。

（3）不同的培養(yǎng)基配比及激素濃度，對(duì)莖段不定芽的誘導(dǎo)率有很大的影響。激素濃度過高、過低都不利于芽的誘導(dǎo)及成苗，經(jīng)過不同濃度梯度的自由組合篩選發(fā)現(xiàn)，MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是適合北海道黃楊莖段不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，不僅能保證較高的誘導(dǎo)率和成苗率，而且褐化程度不高，苗生長(zhǎng)健壯。

（4）建立植物的再生體系主要是利用植物細(xì)胞的全能性，除了利用其根、莖、葉外，還可以利用花、果實(shí)、種子以及其他組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等作為外植體建立再生體系。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

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