N6>B5;以幼嫩葉片為外植體、蔗糖作為碳源、2.0mg·L-16-BA加0.2mg·L-12,4-D的激素配比最有利于苦菜愈傷組織的誘導(dǎo)。關(guān)鍵詞:愈傷組織;誘導(dǎo)條件;外植體中圖分類號(hào):S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI:10.19754/j.nyyjs.20201115001收稿日期:2020"/>

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        苦菜愈傷組織誘導(dǎo)的初步研究

        2020-12-15 06:47:09李闖楚海嬌劉磊譚化王洋王鳳張海王忠偉
        農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2020年21期

        李闖 楚海嬌 劉磊 譚化 王洋 王鳳 張海 王忠偉

        摘 要:以苦菜幼嫩葉片和葉柄作為外植體,采用3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基、添加不同2,4-D濃度及碳源進(jìn)行苦菜愈傷組織誘導(dǎo)。結(jié)果表明:3種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果為MS>N6>B5;以幼嫩葉片為外植體、蔗糖作為碳源、2.0mg·L-16-BA加0.2mg·L-12,4-D的激素配比最有利于苦菜愈傷組織的誘導(dǎo)。

        關(guān)鍵詞:愈傷組織;誘導(dǎo)條件;外植體

        中圖分類號(hào):S-3

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

        DOI:10.19754/j.nyyjs.20201115001

        收稿日期:2020-10-15

        基金項(xiàng)目:吉林省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):20200702017NC)

        作者簡(jiǎn)介:李闖(1984-),男,助理研究員。研究方向:馬鈴薯的育種和栽培;通訊作者王忠偉,男,研究員。研究方向:馬鈴薯的育種和栽培。

        苦菜[Ixeris Chinensis(Thunb.) Nakai]又稱苦苣菜,是一種藥食同源的無(wú)毒野生植物[1]??嗖擞酌绺缓鞍踪|(zhì)、糖類、維生素、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分,具有很高的食用價(jià)值[2]。同時(shí)其藥用價(jià)值也不容忽視,很多古典文獻(xiàn)上都出現(xiàn)了以苦菜為中藥成分的記載。研究表明,苦菜不僅具有殺菌消炎、防止貧血、清熱解毒等作用[3],同時(shí)對(duì)葡萄球菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌有抑制作用[4]。為了使得苦菜的藥用價(jià)值不斷提升,有關(guān)苦菜生物活性物質(zhì)的研究報(bào)道越來(lái)越多,而對(duì)苦菜的組織培養(yǎng)研究報(bào)道較少。組織培養(yǎng)屬于無(wú)性生殖的范疇,該技術(shù)對(duì)于培育新品種、快速繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)資源保護(hù)和相關(guān)藥品開(kāi)發(fā)等方面具有非常重要的意義[5]。愈傷組織的誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)的起始階段,能否得到生長(zhǎng)旺盛和易于分化的愈傷組織是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵[6]。培養(yǎng)基在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起決定性作用,其會(huì)影響苦菜愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根等一系列過(guò)程。本試驗(yàn)分別采用苦菜葉片和葉柄作為外植體,在3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織,同時(shí)探討不同2,4-D濃度和碳源的影響,以期獲得苦菜愈傷組織的最佳誘導(dǎo)條件,旨在為苦菜的快速繁殖提供有效途徑,同時(shí)為苦菜遺傳轉(zhuǎn)化和細(xì)胞工程研究創(chuàng)造有利條件[7]。

        1?材料與方法

        1.1?試驗(yàn)材料

        野生苦菜,采于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校園。

        1.2?誘導(dǎo)培養(yǎng)基

        MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基。

        1.3?試驗(yàn)方法

        1.3.1?材料滅菌

        選取葉片和葉柄分別放入500mL燒杯中,用自來(lái)水洗滌4次,每次約1min。分別用0.1%的HgCl2和70%的酒精浸泡消毒,無(wú)菌水沖洗[8,9]。

        1.3.2?愈傷組織誘導(dǎo)條件的篩選

        1.3.2.1?培養(yǎng)基的篩選

        配制MS、N6和B5 3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。在此過(guò)程中,不定芽較易萌發(fā),影響愈傷組織的生長(zhǎng),用鑷子將芽夾去,可以提高愈傷誘導(dǎo)率。

        1.3.2.2?外植體的篩選

        將消毒后的嫩葉切成1cm2大小的方塊,葉柄為1cm左右的小段,接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

        1.3.2.3?2,4-D濃度的篩選

        配制2,4-D濃度分別為0.00mg·L-1、0.05mg·L-1、0.10mg·L-1、0.20mg·L-1、0.50mg·L-1的MS培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。

        1.3.2.4?碳源的篩選

        配制不含碳源和含有相同濃度蔗糖、葡萄糖及麥芽糖的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn),觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

        1.3.3?誘導(dǎo)率的計(jì)算

        誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

        2?結(jié)果與討論

        2.1?培養(yǎng)基的篩選

        誘導(dǎo)培養(yǎng)基中包含大量元素、微量元素、有機(jī)元素、生長(zhǎng)激素及碳源等[10],其植物生長(zhǎng)提供所需的各種營(yíng)養(yǎng)成分。本試驗(yàn)中MS、N6、B5 3種培養(yǎng)基對(duì)苦菜愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生了不同效果。接種14d左右時(shí)發(fā)現(xiàn),在MS培養(yǎng)基中的葉片卷曲,切口處有突起,開(kāi)始出現(xiàn)初始愈傷。繼續(xù)培養(yǎng)28d左右發(fā)現(xiàn),N6和B5培養(yǎng)基中的葉片表面也開(kāi)始有初始愈傷出現(xiàn);而此時(shí)以葉柄為外植體的3種培養(yǎng)基中也均誘導(dǎo)出初始愈傷。繼續(xù)培養(yǎng)直至所有愈傷組織狀態(tài)穩(wěn)定后,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

        由表1可以看出,在MS培養(yǎng)基中,葉片和葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率均最高,其原因可能為MS培養(yǎng)基中氮、鉀等無(wú)機(jī)鹽濃度較高,能促進(jìn)愈傷組織的快速形成[11];葉片在N6培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率也較高,但形成愈傷組織所需的時(shí)間較長(zhǎng);而在B5培養(yǎng)基中的出愈率僅為12%,且長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)葉片絕大部分褐化。以葉柄為外植體,在N6和B5培養(yǎng)基中的出愈率均較低。因此認(rèn)為,3種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果為MS>N6>B5。在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí),經(jīng)常出現(xiàn)褐化現(xiàn)象,有試驗(yàn)表明酚類物質(zhì)的含量增加時(shí),褐化率也隨之增大,成活率隨之減小[12]。本試驗(yàn)中由于外植體切塊太小、所用培養(yǎng)基不適宜而造成了部分褐化現(xiàn)象。

        2.2?外植體的篩選

        試驗(yàn)分別選取苦菜葉片和葉柄作為外植體。接種14d左右時(shí)發(fā)現(xiàn),在MS培養(yǎng)基中的葉片卷曲,切口處有突起,開(kāi)始出現(xiàn)初始愈傷。繼續(xù)培養(yǎng)28d左右發(fā)現(xiàn),以葉柄為外植體的3種培養(yǎng)基中也均誘導(dǎo)出初始愈傷。繼續(xù)培養(yǎng)直至所有愈傷組織狀態(tài)穩(wěn)定后,此時(shí)可進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)表2)。

        由表2可以看出,MS培養(yǎng)基中的葉片誘導(dǎo)率高于葉柄,但二者相比較,葉柄生長(zhǎng)速度較慢,往往需要較長(zhǎng)時(shí)間才能形成可見(jiàn)的初始愈傷,同時(shí)褐化現(xiàn)象也較嚴(yán)重;在N6培養(yǎng)基中,葉片的誘導(dǎo)率也較高,因此認(rèn)為葉片更適合作為苦菜愈傷組織誘導(dǎo)的外植體。進(jìn)行植物愈傷組織誘導(dǎo)時(shí),應(yīng)盡量選擇易于增殖和再生,具有良好遺傳穩(wěn)定性的外植體。

        2.3?2,4-D濃度的篩選

        2,4-D濃度是影響植物愈傷組織誘導(dǎo)率的一個(gè)重要激素[13]。6-BA和2,4-D在愈傷組織形成的不同時(shí)期具有明顯促進(jìn)作用,6-BA與植株再生有關(guān),2,4-D與愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān),是愈傷組織生長(zhǎng)的關(guān)鍵[14]。本試驗(yàn)在愈傷組織誘導(dǎo)階段采用6-BA和2,4-D 2種激素,固定6-BA的濃度為2.0mg·L-1,選取5種濃度的2,4-D進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

        由表3可以看出,2,4-D濃度為0.2mg·L-1時(shí),苦菜愈傷組織的誘導(dǎo)率最高,且愈傷組織狀態(tài)良好,大部分呈黃綠色,結(jié)構(gòu)松軟;當(dāng)2,4-D濃度>0.2mg·L-1時(shí),誘導(dǎo)率隨2,4-D濃度的增大而減小,誘導(dǎo)形成的愈傷組織大部分為淺綠色,結(jié)構(gòu)較為致密,生長(zhǎng)速度較慢,并且出現(xiàn)嚴(yán)重褐化,表明高濃度的2,4-D不利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng),同時(shí)加快外植體的褐化;當(dāng)2,4-D濃度<0.2mg·L-1時(shí),誘導(dǎo)率隨2,4-D濃度的減小而減小;當(dāng)2,4-D濃度=0時(shí),愈傷組織全部死亡。

        2.4?碳源的篩選

        細(xì)胞的生長(zhǎng)不僅需要能量,還需要調(diào)節(jié)生長(zhǎng)環(huán)境中的滲透壓,糖作為碳源能夠滿足這些需求,因此培養(yǎng)基中的碳源是培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵因素[15]。本試驗(yàn)分別在培養(yǎng)基中加入濃度為30g·L-1 3種碳源進(jìn)行苦菜愈傷誘導(dǎo)研究,結(jié)果表明,培養(yǎng)14d后,含有蔗糖的培養(yǎng)基中的苦菜葉片表面形成初始愈傷,其它培養(yǎng)基中的葉片無(wú)明顯變化;培養(yǎng)21d左右,添加葡萄糖的培養(yǎng)基中的葉片表面也開(kāi)始形成愈傷,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

        結(jié)果顯示,不加碳源的培養(yǎng)基中無(wú)愈傷組織形成,說(shuō)明碳源是苦菜葉片愈傷組織形成的必要元素。分別添加不同碳源的3種培養(yǎng)基中均有愈傷組織形成,但誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)效果存在很大差別。添加蔗糖的培養(yǎng)基中的出愈率高達(dá)到96%,且愈傷組織呈黃綠色,結(jié)構(gòu)松軟,生長(zhǎng)狀態(tài)良好;添加葡萄糖的培養(yǎng)基中的出愈率不足50%,且呈現(xiàn)淺綠色,結(jié)構(gòu)較為致密,生長(zhǎng)情況較差;麥芽糖的誘導(dǎo)效果最差,幾乎沒(méi)有完整的愈傷組織形成,只有少量葉片的切口處出現(xiàn)點(diǎn)狀突起。由此可見(jiàn),蔗糖為苦菜愈傷組織誘導(dǎo)的最適碳源。

        2.5?愈傷組織的繼代培養(yǎng)

        固定2,4-D濃度為0.1mg·L-1,分別配制MS、N6和B53種培養(yǎng)基進(jìn)行繼代試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在N6和B5培養(yǎng)基上,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加苦菜葉片愈傷組織的存活數(shù)減少,直到最后全部褐化死亡,其中B5褐化的速度最快,因此這2種培養(yǎng)基不適合繼代培養(yǎng);而接種到MS培養(yǎng)基上的大部分生長(zhǎng)良好,能保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài),并成功分化出苗。

        3?結(jié)論

        本試驗(yàn)采用不同培養(yǎng)基、外植體、2,4-D濃度和碳源種類對(duì)苦菜愈傷組織進(jìn)行初步誘導(dǎo)研究。得出以下結(jié)論:以苦菜葉片和葉柄做外植體,3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果均為MS>N6>B5;同時(shí)苦菜的2種外植體均能誘導(dǎo)形成愈傷組織,但葉片的誘導(dǎo)率要高于葉柄,且愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)較好,誘導(dǎo)時(shí)間較短,所以苦菜葉片較適合作為苦菜愈傷誘導(dǎo)的外植體。試驗(yàn)表明,2,4-D濃度為0.2mg·L-1時(shí)適合苦菜葉片愈傷組織的誘導(dǎo);3種碳源的誘導(dǎo)效果比較發(fā)現(xiàn),蔗糖>葡萄糖>麥芽糖,因此蔗糖可作為理想碳源;繼代培養(yǎng)時(shí),愈傷組織在MS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況良好且培養(yǎng)后愈傷組織活性很高,能夠繼續(xù)進(jìn)行分化培養(yǎng),同時(shí)在繼代培養(yǎng)時(shí)應(yīng)適當(dāng)降低2,4-D濃度。

        本試驗(yàn)僅對(duì)影響苦菜愈傷組織誘導(dǎo)的條件進(jìn)行優(yōu)化,為建立完善的苦菜組織培養(yǎng)體系,其繼代、分化及生根培養(yǎng)的影響因素,還有待于進(jìn)一步研究。

        參考文獻(xiàn)

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        (責(zé)任編輯?李媛媛)

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