曹 敏，張曉敏，王培昌，劉 靜

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗科，北京 100053)

固有淋巴樣細胞(ILCs)是最近發(fā)現(xiàn)的一種天然免疫細胞，ILCs是由造血干細胞(HSC)分化而來，HSC向ILCs分化的途徑為：長期造血干細胞(LT-HSCs)→ 短期造血干細胞(ST-HSCs)→多能祖細胞(MPPs)→共同淋系祖細胞(CLP )→髓樣淋巴祖細胞(CMP)→ILC前體細胞(ILCP)→各類ILCs[1]。ILCs主要分為3個亞群：ILC1亞群(ILC1s)、ILC2亞群(ILC2s)和ILC3亞群(ILC3s)[2]。目前研究認為，ILC1s存在于腸道和肝臟中，在病毒感染早期及肝臟損傷中發(fā)揮免疫作用[3-4]；ILC2s主要存在與腸道、肺部和血液中，與哮喘、過敏性皮炎有關(guān)[5-6]；ILC3s主要存在于淋巴結(jié)和腸道中，在炎癥性腸病及清除胞內(nèi)寄生菌感染中發(fā)揮免疫作用[7-8]。目前檢測小腸組織中ILC3頻率的方法主要依靠流式細胞術(shù)結(jié)合胞內(nèi)染色，但是在染色過程中諸多因素會影響檢測結(jié)果。由于小腸中ILC3含量較少且含有胞內(nèi)抗原，需對其固定破膜后染色，固定破膜效果如何將成為影響小腸中ILC3檢測水平的一項重要因素[9]。本研究中，課題組比較不同廠家的破膜試劑(BD公司破膜劑、eBioscience公司破膜劑、聯(lián)科生物公司破膜劑)對小腸中ILC3檢測效率的影響，目的在于提高小腸組織中ILC3檢出頻率，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物實驗小鼠 均為無特定病原體(SPF)級雌性小鼠(月齡3個月)，體質(zhì)量(20±5)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2儀器 Gallios流式細胞儀(美國 Beckman公司)，高速冷凍離心機(美國Thermo Scientific公司)，1 mL注射器、1.5 mL、50 mL離心管(北京蘭博利德商貿(mào)有限公司)，200目尼龍紗網(wǎng)、流式細胞儀試管(美國BD公司)。

1.1.3試劑 eBioscience公司Transcription Factor Staining Buffer Set破膜劑(貨號：00-5523-00)，BD公司Cytofix/Cytoperm破膜劑(貨號：554714)，聯(lián)科生物公司Fix&Perm Kit破膜劑(貨號：70-GAS003)?？剐∈驦in-405、抗小鼠CD45-FITC、抗小鼠CD127-PECy7、抗小鼠RORγt-APC購自eBioscience公司。3.5%水合氯醛、10×磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉、Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)、5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、膠原酶、Dnase I購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries公司。

1.2方法

1.2.1小腸組織單細胞懸液制備 取月齡3個月的實驗小鼠,3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頸處死，剪開腹部皮膚，暴露腹腔臟器，用手術(shù)剪在胃與十二指腸連接處、回盲腸連接處剪斷，分離全段小腸置于1%冷PBS中，剝除腸系膜并用1%冷PBS沖洗小腸，剪下小腸派爾集合淋巴結(jié)(PP結(jié))，將小腸置于5～10 mL solution Ⅰ(HBSS+5 mmol/L EDTA+10 mmol/L HEPES)中，37 ℃ 100 r/min搖床中消化15～20 min，重復(fù)4～5次，直至小腸組織呈無色透明狀，棄上清液并收集小腸組織置于solution Ⅱ(HBSS+2%FBS+0.5 mg/mL膠原酶Ⅱ+0.5 mg/mL膠原酶Ⅲ+0.5 mg/mL DNase Ⅰ)中，再次消化，37 ℃ 100 r/min搖床中消化30 min，重復(fù)2～3次，將小腸組織消化液于200目尼龍紗網(wǎng)中過濾后，將上清液收集于50 mL離心管中[10]。

1.2.2細胞染色 將收集的小腸組織單細胞懸液根據(jù)使用的破膜劑分為3組:eBioscience組(EB組)、BD組、聯(lián)科組(MS組)。每份標(biāo)本中分別加入Lin-405、CD45-FITC、CD127-PECy7進行表面染色，冰上避光孵育1 h，3 000 r/min離心1 min，3組標(biāo)本中分別加入不同公司的適量破膜劑，溫度4 ℃，分10、20及60 min 3種不同處理時間，用配套的破膜洗液洗滌兩遍后，在小腸組織單細胞懸液標(biāo)本中分別加入RORγt-APC抗體冰上避光染色1 h，染色結(jié)束后分別加入適量配套的破膜洗液洗滌兩遍，2 h內(nèi)上機檢測。

1.2.3樣品檢測與分析 開啟Gallios流式細胞儀在前向角散射光(FSC)/側(cè)向角散射光(SSC)散點圖中顯示細胞群，圈出淋巴細胞群，利用ISO管、單陽管調(diào)節(jié)電壓、補償?shù)葏?shù)。在淋巴細胞群中，圈出Lin-CD45+CD127+RORγt+的ILC3[11]，利用FlowJo (version 7.6)軟件分析細胞群比例。

2 結(jié) 果

2.1小鼠小腸ILC3圈門策略 如圖1所示，可見明顯ILC3細胞群。相同破膜時間不同組別中小腸ILC3典型圖如圖2所示。將相同破膜時間不同破膜劑處理的ILC3檢出頻率進行比較，發(fā)現(xiàn)EB組[(19.66±0.33)%]和BD組[(20.73±0.49)%] Lin-CD45+CD127+RORγt+的ILC3檢出率高于MS組[(10.79±0.25)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但BD組和EB組小腸組織中ILC3的檢出頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，如圖3所示。

注：A為小腸中淋巴細胞群分布；B為淋巴細胞群；C為Lin-細胞群；D為CD127+RORγt+的ILC3。

2.2破膜時間對檢測小腸中ILC3頻率的影響 3種破膜劑分別對小腸ILC3處理不同時間，結(jié)果表明，對細胞處理10 min，破膜效果較差，然而破膜60 min，破膜過度，小腸ILC3檢出頻率低，細胞形態(tài)受破壞。當(dāng)細胞處理20 min時，破膜效果最佳，小腸中ILC3檢出頻率最高。見表1。

注：A為MS組小腸ILC3頻率；B為EB組小腸ILC3頻率；C為BD組小腸ILC3頻率。

注：與MS組比較，*P<0.05；“n.s.”表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 破膜時間對3組破膜劑檢測ILC3細胞頻率的影響

2.3實驗的可重復(fù)性 在相同實驗條件下，同一份標(biāo)本由不同操作者進行，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，同一份標(biāo)本由同一操作者重復(fù)2遍，CV值均小于5%。

3 討 論

隨著流式細胞技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細胞術(shù)廣泛應(yīng)用于各大實驗室，特別是隨著激光管的不斷增加，熒光素的不斷開發(fā)，多色流式細胞儀的應(yīng)用能夠更加快速準(zhǔn)確靈敏地檢測多個指標(biāo)，例如在檢測自然殺傷(NK)細胞和ILC1時，NK細胞與ILC1均屬于第一類ILC細胞，且由于ILCs發(fā)現(xiàn)較晚，ILC1常與NK細胞相混淆，但由于多色流式細胞技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)在CD3-NKp46+NK1.1+的基礎(chǔ)上，CD49a+CD49b-的細胞是ILC1，而CD49a-CD49b+的細胞是NK細胞[12]。在原有基礎(chǔ)上，增加兩種熒光素，能夠準(zhǔn)確區(qū)分兩種不同細胞，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

利用流式細胞術(shù)檢測細胞時，對于胞內(nèi)抗原染色，細胞的固定與破膜是否恰當(dāng)將嚴重影響染色效果，目前常用的破膜劑主要是BD Cytofix/Cytoperm試劑盒、Beckman Coulter試劑盒、eBioscience Fix & Perm試劑盒等，選擇合適的破膜劑，能夠更好地保持細胞的大小和完整性，增加細胞膜的通透性。本實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)用EB公司的破膜劑和BD公司破膜劑能夠更好的檢測出小腸中ILC3，在多次實驗中發(fā)現(xiàn)，使用配套的破膜洗液洗滌細胞后，能夠有效地減少非特異性結(jié)合，并提高染色效率。但延長破膜時間并沒有提高破膜效率，反而由于破膜時間過長，細胞腫脹，可能會導(dǎo)致細胞死亡。對于低水平表達的抗原，在做配色時，應(yīng)選擇強熒光集團，并適當(dāng)增加染色時間，以提高染色效率，同時當(dāng)流式標(biāo)本制作完成后，應(yīng)盡快進行上機檢測，減少細胞死亡，使實驗結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本實驗所研究的ILC3屬于第三類ILCs，ILC3分為NKp46+的ILC3和NKp46-的淋巴樣組織誘導(dǎo)細胞(LTi)[13]，ILC3主要存在于腸道、皮膚黏膜中，受到TCF1、Notch和RUNX1等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[14]。ILC3主要存在于小腸固有層，產(chǎn)生IL-22和IL-17等細胞因子，對維持腸道免疫功能發(fā)揮重要作用[14]。在利用流式細胞儀檢測小腸中ILC3時，由于RORγt屬于胞內(nèi)抗原，且抗原表達水平較低，本實驗室選擇了熒光素較強的APC做配色[15]，同時選用合適的破膜劑，能夠更好的檢測小腸內(nèi)ILC3。流式細胞術(shù)作為一項被廣泛應(yīng)用的實驗技術(shù)，在開始正式實驗前，應(yīng)仔細考慮本實驗的配色方案是否合理，并利用少量標(biāo)本進行預(yù)實驗，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，調(diào)整實驗方法，最終獲得理想的實驗結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究通過比較不同公司破膜劑對檢測小鼠小腸中ILC3頻率的影響，發(fā)現(xiàn)EB公司破膜劑和BD公司破膜劑能提高流式細胞儀檢測頻率，同時驗證了增加破膜時間并不能提高破膜效率。本研究比較了3種不同公司的破膜劑對檢測小鼠小腸中ILC3的影響，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。