劉 琳，姜世敏，卓 莉，徐 波，許世清，向 青，高紅梅，李文歌★

（1.中日友好醫(yī)院 腎病科，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 臨床研究所，北京 100029）

腺苷和腺苷A1 受體（adenosine A1 receptor，A1AR）介導(dǎo)了管球反饋（tubular golmerular feedback，TGF），A1AR 的阻斷能夠消除TGF。但近年來(lái)進(jìn)一步的研究顯示，選擇性阻斷入球小動(dòng)脈平滑肌上的A1AR 仍有約36%的TGF 現(xiàn)象存在，提示腎小球其他細(xì)胞表達(dá)的A1AR 也在參與TGF調(diào)節(jié)[1]。系膜細(xì)胞作為腎小球毛細(xì)血管襻的支撐，被血管活性物質(zhì)刺激后可發(fā)生收縮，參與調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過(guò)率，但其A1AR 表達(dá)情況以及A1AR 究竟是否參與系膜細(xì)胞收縮的調(diào)節(jié)，尚缺乏確切的證據(jù)。本研究在原代腎小球系膜細(xì)胞中觀察A1AR 的表達(dá)情況，使用腺苷、A1AR 激動(dòng)劑及抑制劑刺激系膜細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞收縮能力的變化，為系膜細(xì)胞在TGF、腎小球?yàn)V過(guò)率調(diào)節(jié)中的作用及機(jī)制提供更多依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級(jí)野生型6～8 周雄性C57BL/6 小鼠購(gòu)自北京維通利華公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、2.5g/L 胰蛋白酶-EDTA、DMEM 培養(yǎng)基（含葡萄糖5.5mmol/L）購(gòu)于GIBCO 公司。Ⅰ型膠原蛋白購(gòu)于Corning 公司（354236），Ⅳ型膠原酶購(gòu)于Gibco 公司（17104-19）。CCK-8 試劑盒購(gòu)于上海東仁化學(xué)科技有限公司。抗小鼠desmin 抗體購(gòu)于Proteintech 公司 （16520-1-AP），抗小鼠synaptopodin 抗體購(gòu)于Progen 公司 （61094），抗小鼠A1AR 受體抗體購(gòu)于Abcam 公 司（ab82477）。FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、辣根標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)于北京中杉金橋公司。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、腺苷、N6-cyclohexyladenosine（CHA）、8-Cyclopentyl-1，3-dipropylxanthine （DPCPX） 購(gòu)于Sigma 公司。

1.2 原代小鼠系膜細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定

參照文獻(xiàn)[2]中的分樣篩法，斷頸處死3 只C57BL/6 小鼠，于75%酒精浸泡1min。無(wú)菌條件下剖開(kāi)腹部取出兩側(cè)腎臟，用冰冷的無(wú)菌PBS 清洗2 遍。剪下腎皮質(zhì)，放入少量Ⅳ膠原酶中（1mg每個(gè)腎臟），將皮質(zhì)剪成碎末，使用研缽一定程度的研磨后轉(zhuǎn)移至50ml 離心管中，37℃水浴消化40min 后加適量含血清的培養(yǎng)基終止消化。收集腎組織混懸液體，用大量PBS 充分沖洗同時(shí)使其先后通過(guò)孔徑為70μm 和40μm 篩網(wǎng)，使用無(wú)菌吸管收集40μm 篩網(wǎng)上的腎小球懸液，移入15ml離心管。以1000r/min 離心5min，棄上清，加入含20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基制成腎小球懸液，隨后轉(zhuǎn)移入1 型膠原蛋白包被過(guò)的無(wú)菌培養(yǎng)皿，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每3d 換液（3d 內(nèi)避免移動(dòng)培養(yǎng)皿），7～10d 后腎小球明顯縮小甚至消失，爬出的細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶皿后進(jìn)行傳代，前三代使用20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，此后使用15%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。5 代后細(xì)胞形態(tài)一致性良好，腎小球完全消失，經(jīng)免疫熒光染色Desmin（+）、synaptopodin（-）鑒定為系膜細(xì)胞，8 代以內(nèi)的系膜細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)腺苷刺激系膜細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

以2000 個(gè)細(xì)胞/100μl/孔鋪96 孔板，每個(gè)濃度3 個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100μl 無(wú)血清培養(yǎng)基和10μl CCK-8/孔，孵育2h 后于酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值，此點(diǎn)設(shè)置為0 點(diǎn)。向培養(yǎng)板加入10μl 不同濃度的腺 苷，使 其 分 別 達(dá) 到0.1μM、1μM、10μM 及100μM 濃度，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h 使用上述方法加入CCK-8 試劑進(jìn)行檢測(cè)，并與不加腺苷的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。

1.4 細(xì)胞免疫熒光染色

以1×104個(gè)細(xì)胞/孔鋪24 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%融合時(shí)4%多聚甲醛固定液室溫固定15min。PBS 漂洗，室溫下用0.5%Triton/PBS 透化處理10min，3%BSA/PBS 37℃封閉30min。在細(xì)胞爬片上分別滴加約50μl 1：200 稀釋的desmin抗體、synaptopodin 抗體或A1AR 抗體，密封于濕盒中，37℃孵育30min，避免震蕩。漂洗后在細(xì)胞爬片上加約50μl 1：50 稀釋的FITC 標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗，37℃孵育30min。漂洗后加入1：2000稀釋的DAPI，室溫孵育5min。漂洗后取10μl 封片劑滴在載玻片上，將細(xì)胞爬片有細(xì)胞的一面朝下封片，盡快在激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

1.5 Western blot

使用SDS 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，每孔加入20μg 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGEs 凝膠電泳分離，之后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，分別加入抗1：500 稀釋的A1AR 抗體、1：1000 稀釋的β-actin 抗體，4℃過(guò)夜。TBST洗滌后加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育1h。洗膜后加入ECL 化學(xué)發(fā)光劑，于凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.6 細(xì)胞收縮功能的檢測(cè)

以5×104個(gè)細(xì)胞/孔將小鼠腎小球系膜細(xì)胞鋪于直徑為35mm 的免疫熒光專(zhuān)用培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后（約4h），將細(xì)胞在不同條件下培養(yǎng)。正常對(duì)照組使用普通DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；腺苷刺激組在DMEM 培養(yǎng)基中加入終濃度為100μmol/L的腺苷；A1AR 激動(dòng)劑刺激組，DMEM 培養(yǎng)基中加入終濃度為1μmol/L 的A1AR 激動(dòng)劑CHA；A1AR 抑制劑刺激組，DMEM 培養(yǎng)基中加入終濃度為1μmol/L 的A1AR 抑制劑DPCPX。培養(yǎng)48h后使用Olympus IX83 活細(xì)胞顯微成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞收縮情況。將培養(yǎng)皿放入操作體系中，0 點(diǎn)拍照后原位更換為含1μM AngⅡ的培養(yǎng)基，關(guān)閉培養(yǎng)體系，維持溫度37℃，5% CO2濃度的條件，在40 倍物鏡同一視野下，連續(xù)觀察30min，每2min拍照1 張，最后制作為動(dòng)態(tài)影像。應(yīng)用Image J 軟件計(jì)算每個(gè)細(xì)胞在0 時(shí)和30min 時(shí)的面積變化絕對(duì)值，對(duì)比各組之間的差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以χ±s 表示，先行單因素方差分析，方差齊性檢驗(yàn)后，組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 原代系膜細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

提取出的腎小球使用20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下孵育3d 后，相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)腎小球內(nèi)有細(xì)胞爬出（圖1A，見(jiàn)封二）。10d 后腎小球明顯縮小甚至消失，爬出的細(xì)胞可長(zhǎng)滿瓶皿（圖1B，見(jiàn)封二）。第一次傳代后每3d 傳代1 次，傳至第5 代，細(xì)胞一致性良好，腎小球完全消失。此時(shí)行Desmin 染色為陽(yáng)性（圖2，見(jiàn)封二），Synaptopodin 染色陰性，鑒定為系膜細(xì)胞。

圖1 小鼠原代系膜細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程（×100）。A.提取小鼠腎小球并培養(yǎng)3d后細(xì)胞從腎小球內(nèi)爬出；B.提取小鼠腎小球培養(yǎng)10d后細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶皿。圖2 小鼠系膜細(xì)胞desmin免疫熒光染色（×400）。圖3 免疫熒光染色觀察到A1AR于系膜細(xì)胞胞漿內(nèi)呈顆粒狀表達(dá)（×200），箭頭所示為A1AR陽(yáng)性區(qū)域。A.綠色為FITC標(biāo)記陽(yáng)性區(qū)域；B.藍(lán)色為DAPI染色陽(yáng)性區(qū)域。

2.2 腺苷對(duì)系膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

表1 示，使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，觀察到0.1μM、1μM、10μM 及100μM 濃度的腺苷在24h、48h、72h 內(nèi)，與不加腺苷的正常對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)量均無(wú)明顯差異，提示腺苷對(duì)小鼠原代系膜細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響（均P＞0.05）。

圖4 Western blot 方法驗(yàn)證系膜細(xì)胞存在A1AR 表達(dá)

圖6 AngⅡ刺激前后系膜細(xì)胞面積變化

2.3 小鼠系膜細(xì)胞A1AR 表達(dá)情況

細(xì)胞免疫熒光染色顯示，A1AR 在小鼠腎小球系膜細(xì)胞中存在表達(dá)，并呈現(xiàn)細(xì)小顆粒狀分布于胞漿中（圖3，見(jiàn)封二）。同時(shí)，使用western blot技術(shù)也觀察到原代小鼠腎小球系膜細(xì)胞能夠表達(dá)A1AR，在36KD 水平可見(jiàn)深色條帶（圖4）。

表1 不同濃度腺苷刺激系膜細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的OD 值

2.4 腺苷及A1AR 對(duì)系膜細(xì)胞收縮能力的影響

如圖5（見(jiàn)封二）、圖6 所示，100μmol/L 腺苷刺激48h 后，小鼠系膜細(xì)胞在AngⅡ刺激下收縮明顯更為劇烈，30min 后細(xì)胞面積顯著縮小，面積變化值達(dá)到8947±3658pixels，顯著大于正常對(duì)照組4268±2131pixels（P＜0.05），面積變化的幅度達(dá)到正常對(duì)照組2 倍以上。1μmol/L A1AR 激動(dòng)劑CHA 刺激48h 后，系膜細(xì)胞顯現(xiàn)出類(lèi)似于腺苷的對(duì)AngⅡ的顯著收縮反應(yīng)，面積變化值為9813±1640pixels，同樣顯著大于正常對(duì)照組（P＜0.05），與腺苷刺激組接近。使用1μmol/L A1AR 抑制劑DPCPX 刺激48h 后，系膜細(xì)胞對(duì)AngⅡ的收縮反應(yīng)減弱，僅為2613±2546 pixels，顯著弱于腺苷及CHA 刺激組（P＜0.05），也低于正常對(duì)照組，但差異不具有顯著性。

圖5 AngⅡ刺激前后系膜細(xì)胞面積變化。A、B、C、D：AngⅡ刺激前；E、F、G、H：AngⅡ刺激30min后；A、E：正常對(duì)照組（NC）；B、F：腺苷刺激組；C、G：A1AR激動(dòng)劑組（CHA）；D、H：A1AR抑制劑組（DPCPX）。腺苷和CHA組AngⅡ刺激前后面積變化顯著大于NC組；DPCPX組AngⅡ刺激前后面積變化不顯著，明顯弱于腺苷和CHA組。

3 討論

3.1 腺苷及A1AR 在腎臟血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)中的作用

近年來(lái)，腺苷及其受體在血管舒縮調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用備受關(guān)注。腺苷是由糖苷鍵連接腺嘌呤和核糖而成的嘌呤核苷，在生理情況下以低濃度廣泛分布于身體各種組織的細(xì)胞間液中。低氧、缺血、炎癥、應(yīng)激等刺激條件下，腺苷大量生成，目前大多研究認(rèn)為在以上病理生理過(guò)程中腺苷可起到一定的保護(hù)作用[3，4]。腺苷通過(guò)腺苷受體發(fā)揮作用，目前已知的腺苷受體 （adenosine receptor，AR）有3 大類(lèi)，包括A1AR、A2AR、A3AR，其中A2AR 又分為2 個(gè)亞類(lèi)：A2aAR、A2bAR、均為G 蛋白耦聯(lián)受體。在大多數(shù)血管中，腺苷促進(jìn)血管舒張主要由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的A2aAR 和A2bAR 通過(guò)激活GSα和蛋白激酶A 通路介導(dǎo)[5]。而A1AR 僅表達(dá)在有限的部位，腎組織內(nèi)主要表達(dá)在入球小動(dòng)脈、球旁器顆粒細(xì)胞及近曲小管上皮細(xì)胞等[5～7]。入球小動(dòng)脈給予A2AR 激動(dòng)劑CGS21680 造成管壁舒張，給予A1AR 激動(dòng)劑CHA 引起管壁收縮，提示與大多數(shù)血管相同，在入球小動(dòng)脈，A2AR 主要舒張管壁，A1AR 則產(chǎn)生收縮管壁的作用[8～10]。A1AR 敲除的小鼠TGF 完全缺失[11，12]，人為上調(diào)A1AR 表達(dá)可使TGF 加強(qiáng)[13]，提示A1AR 是維持TGF 正常進(jìn)行的關(guān)鍵蛋白。然而，隨著技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)選擇性敲除入球小動(dòng)脈表達(dá)的A1AR，再通過(guò)顯微分離灌注觀察單個(gè)腎小球 （可除外腎素作用），發(fā)現(xiàn)其TGF 并非完全缺失，僅為部分降低[1]，提示入球小動(dòng)脈并非唯一表達(dá)A1AR 并直接介導(dǎo)TGF調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)。

系膜細(xì)胞是連接并支持腎小球毛細(xì)血管袢的主要結(jié)構(gòu)，具有舒縮功能，能夠調(diào)節(jié)毛細(xì)血管袢濾過(guò)面積，有參與TGF 的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。我們查閱到A1AR 在系膜細(xì)胞的表達(dá)此前偶有報(bào)道，但主要是集中在大鼠標(biāo)本中[6，14]，對(duì)于小鼠的研究比較少，且其具體功能尚不完全清楚。因此我們希望通過(guò)本研究，證實(shí)A1AR 在小鼠系膜細(xì)胞的確有表達(dá)，并觀察其表達(dá)部位，進(jìn)而探究腺苷和A1AR激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)系膜細(xì)胞舒縮功能的影響，旨在為系膜細(xì)胞參與TGF 調(diào)節(jié)提供更多理論依據(jù)。

3.2 A1AR 在系膜細(xì)胞中的表達(dá)以及腺苷和A1AR 參與系膜細(xì)胞收縮的作用

本研究嘗試使用文獻(xiàn)報(bào)道較多的分樣篩法分離小鼠原代系膜細(xì)胞[2，15]，將腎皮質(zhì)成分研磨后通過(guò)不同孔徑的篩網(wǎng)，最終獲得純化并經(jīng)過(guò)膠原酶消化的腎小球。此法獲得的腎小球固有細(xì)胞主要有3 種：系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞。原代上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)一般需要從幼年動(dòng)物腎臟提取，本實(shí)驗(yàn)選用6～8 周齡小鼠為青壯年，不利于上述2 種細(xì)胞存活。此外，內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基通常需要依賴(lài)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，上皮細(xì)胞也需要特殊培養(yǎng)液，因此通過(guò)反復(fù)傳代可達(dá)到系膜細(xì)胞的逐步純化，最終通過(guò)標(biāo)記物免疫熒光染色鑒定為系膜細(xì)胞。

我們使用免疫熒光染色和western blot 方法證實(shí)，A1AR 在小鼠系膜細(xì)胞的確也有表達(dá)，免疫熒光染色展示出A1AR 呈細(xì)顆粒狀分布于系膜細(xì)胞胞漿中。本研究中腺苷對(duì)系膜細(xì)胞的增殖并沒(méi)有明顯的影響。在此前提下，為更好觀察腺苷對(duì)系膜細(xì)胞收縮功能的影響，我們選擇生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的最高濃度，也是文獻(xiàn)當(dāng)中使用較多的濃度——100μM 的腺苷濃度刺激小鼠系膜細(xì)胞，觀察收縮情況的變化。

1μM AngⅡ刺激下系膜細(xì)胞能夠在30min 內(nèi)發(fā)生顯著的收縮，已經(jīng)被多項(xiàng)研究采納用于其收縮功能的評(píng)估。在AngⅡ的刺激下，正常系膜細(xì)胞能夠表現(xiàn)出在數(shù)分鐘內(nèi)收縮的現(xiàn)象，不同狀態(tài)的細(xì)胞收縮程度可能不同，因此被用作一種評(píng)估其收縮能力的常用指標(biāo)[16，17]。本文中使用活體顯微鏡成像系統(tǒng)在Ang Ⅱ刺激后連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察30min，評(píng)估腺苷、A1AR 激動(dòng)劑及A1AR 抑制劑對(duì)小鼠系膜細(xì)胞收縮功能的影響，尚屬首次嘗試。我們觀察到與正常對(duì)照組相比，系膜細(xì)胞在加入腺苷和A1AR 激動(dòng)劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h 后，受到AngⅡ刺激后的30min 內(nèi)收縮幅度明顯增加，而在A1AR 抑制劑培養(yǎng)48h 后，AngⅡ引起的收縮幅度有減弱，并通過(guò)動(dòng)態(tài)影像獲得了更為確切的證據(jù)。同時(shí)，對(duì)AngⅡ刺激前和30min 時(shí)的細(xì)胞面積變化進(jìn)行分析，得到更為量化的研究結(jié)果，證實(shí)了腺苷及A1AR 參與系膜細(xì)胞收縮的調(diào)節(jié)。

綜上，本研究證實(shí)了腺苷及A1AR 是調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞收縮的重要機(jī)制，提示系膜細(xì)胞的舒縮很可能也發(fā)揮了協(xié)同參與TGF 的作用。