曹冰冰，王秋霜，秦丹丹，傅冬和，方開(kāi)星，姜曉輝，李紅建，王青，潘晨東，李波，吳華玲

紅紫芽茶花青素合成關(guān)鍵酶活性與重要酚類(lèi)物質(zhì)相關(guān)性研究

曹冰冰1,2，王秋霜1*，秦丹丹1，傅冬和2，方開(kāi)星1，姜曉輝1，李紅建1，王青1，潘晨東1，李波1，吳華玲1*

1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東省茶樹(shù)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128

以廣東的紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)、丹妃和云南紫娟4種紅紫芽品種（系）為供試材料，以英紅九號(hào)綠芽品種為對(duì)照，通過(guò)分析酶活性研究了紅紫芽茶花青素合成關(guān)鍵酶活性變化規(guī)律，并揭示了其與花青素、茶多酚、兒茶素組分等重要酚類(lèi)物質(zhì)含量的相互關(guān)系。結(jié)果表明，紅紫芽茶花青素合成過(guò)程中，同一季節(jié)不同品種（系）類(lèi)黃酮-3--糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活性與茶多酚總量和花青素含量均顯著正相關(guān)，為花青素合成的關(guān)鍵酶；而苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮合成酶（CHS）、類(lèi)黃酮-3-羥化酶（F3H）、二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）、黃酮醇合成酶（FLS）、花青素合成酶（ANS）和花青素還原酶（ANR）等活性能力與花青素含量變化趨勢(shì)不存在密切的相關(guān)性；春季各樣品兒茶素（C）含量與PAL酶活性顯著正相關(guān)，表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）含量與DFR酶活性存在顯著正相關(guān)；同一季節(jié)不同品種（系）CHS、F3H、ANS以及ANR酶活性與酚類(lèi)物質(zhì)含量無(wú)顯著相關(guān)性。

紅紫芽茶；花青素；酶；多酚

花青素作為自然界中植物色素的重要組成部分，不僅賦予了植物的觀賞價(jià)值，良好的保健功效使其在醫(yī)藥和食品行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。茶樹(shù)作為多年生常綠葉用植物，其鮮葉內(nèi)的花青素含量較少，一般占干物重的0.01%左右，因其單體的不穩(wěn)定性，常與葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等縮合成苷類(lèi)物質(zhì)，形成花青苷，其中較為重要的組分包括飛燕草花青素及其苷、芙蓉花青素及其苷、翹搖紫苷元（又稱(chēng)三策啶）[3]。紅紫芽茶樹(shù)是從自然變異群體選育出的性狀穩(wěn)定、全年新梢呈紫色或紫紅色的一種特異茶樹(shù)資源，其花青素含量都在1%以上，很多研究證實(shí)茶樹(shù)芽葉紫化程度與花青素含量呈極顯著的正相關(guān)性[4]。由于味覺(jué)上花青素呈現(xiàn)出苦味，因此紅紫芽茶樹(shù)鮮葉制作的成品茶葉一般滋味苦澀、葉底發(fā)暗、品質(zhì)不佳[5]。然而，由于近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)紅紫芽茶具有良好的保健功效和應(yīng)用前景，這種特異類(lèi)型茶樹(shù)資源受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

花青素屬于酚類(lèi)物質(zhì)中的一大類(lèi)，其合成途徑是類(lèi)黃酮代謝途徑的一個(gè)支路，所涉及的酶類(lèi)在擬南芥、矮牽牛、玉米等多種物種上已有深入研究。在植物體內(nèi)，苯丙氨酸經(jīng)由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮合成酶（CHS）、類(lèi)黃酮-3-羥化酶（F3H）、二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）等一系列關(guān)鍵酶的酶促反應(yīng)生成花青素，最后經(jīng)花青素糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）和花青素?；D(zhuǎn)移酶（AT）等關(guān)鍵酶的糖基化、?；刃揎椬饔眯纬煞€(wěn)定的花青苷[6-7]。茶樹(shù)中花青素作為酚類(lèi)物質(zhì)的一個(gè)重要組成部分，其合成途徑已被探明（圖1），花青苷既是茶樹(shù)類(lèi)黃酮合成途徑某一分支的最終產(chǎn)物，也有部分作為中間產(chǎn)物，合成兒茶素類(lèi)物質(zhì)以及黃酮苷等[8]。為了研究紅紫芽茶樹(shù)高花青素的形成機(jī)理，國(guó)內(nèi)外學(xué)者目前進(jìn)行了大量的研究，基因方面主要開(kāi)展了合成關(guān)鍵酶和調(diào)控基因的克隆與表達(dá)[9-14]以及外界環(huán)境因素對(duì)其表達(dá)的影響等研究[15-16]；生物學(xué)特性[17]和生化組分方面則在花青素組成及含量[18-20]、分離純化工藝[21-25]、抗病活性[26]等方面做了探討。但是，對(duì)于花青素合成過(guò)程中主要酶類(lèi)活性和花青素、兒茶素等茶葉重要酚類(lèi)物質(zhì)的變化趨勢(shì)，以及二者之間的相關(guān)性研究較為鮮見(jiàn)。因此，本文以自主選育出的紅葉系列（紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)）、紫芽品種（丹妃）和云南的紫娟4個(gè)不同品種（系）為供試材料，研究不同階段紅紫芽茶花青素合成中主要酶類(lèi)活性和酚類(lèi)物質(zhì)的變化規(guī)律，并對(duì)二者的相互關(guān)系進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步解析紅紫芽茶樹(shù)花青素形成機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以紅紫芽品種（系）紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)、丹妃、紫娟為供試材料，以綠芽品種英紅九號(hào)為對(duì)照，上述樣品均來(lái)源于廣東省茶樹(shù)資源庫(kù)（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所坑口咀茶葉基地）。分別于2016年的9月（秋茶）、2017年4月（春茶）、7月（夏茶）3個(gè)季節(jié)采摘嫩梢一芽二葉。樣品采集放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入–80℃冰箱冷凍保存，用于酶活性和鮮葉理化分析。

注：Phenylalanine：苯丙氨酸；Naringenin chalcone：柚皮素查爾酮；Leucocyanidin：無(wú)色花青素；Catechin or epicatechin：兒茶素或沒(méi)食子兒茶素；Eriodictyol：圣草酚；Dihydrokaempferol：二氫山柰素；Kaempferol：山奈素；Flavonol glycosides：黃酮醇糖苷；Proanthocyanins：原花青素；Flavonoid glycosides：黃酮苷；Leuco deiphinidin：無(wú)色飛燕草色素；Gallocatechin or gallo epicatechin：兒茶素或沒(méi)食子兒茶素；Gallic acid：沒(méi)食子酸；β-Glucogallin：β-沒(méi)食子酸葡萄糖；Epigallocatechin-3-gallate：沒(méi)食子兒茶素-3-葡萄糖；Naringenin：柑橘素；Pentahydroxy flavanone：五羥基黃烷酮；Dihydro quercetin：二氫槲皮素；Dihydro myricetia：二氫楊梅素；Cyanidin：矢車(chē)菊素；Quercetin：槲皮素；Myricetia：楊梅素；Deiphinidin：飛燕草色素；Anthocyanins：花青苷；PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸羥化酶；4CL：對(duì)香豆酰CoA連接酶；CHI：查爾酮異構(gòu)酶；CHS：查爾酮合成酶；F3H：黃烷酮-3-羥化酶；F3'H：黃烷酮-3'-羥化酶；ANR：花青素還原酶；F3'5'H：黃烷酮-3',5'-羥化酶；DFR：二羥基黃酮醇還原酶；FLS：黃酮醇合成酶；ANS：花色素合成酶；UFGT：黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶

圖2 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)試劑主要包括：85%的磷酸、酒石酸亞鐵、茚三酮、蒽酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、考馬斯亮藍(lán)、-巰基乙醇、牛血清蛋白、抗壞血酸、Tris-base、亮抑蛋白酶肽（Leupeptin），均為分析純；表兒茶素（Epicatechin，EC）、兒茶素（Catechin，C）、表沒(méi)食子兒茶素（Epigallatecatechin，EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallatecatechin gallate，EGCG）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（Catechingallate，CG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Gallate catechingallate，GCG）和沒(méi)食子兒茶素（Gallate catechin，GC），均為標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（ELISA KIT）購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722S型可見(jiàn)分光光度儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；5417型冷凍式離心機(jī)（德國(guó)艾本德有限公司）；1500型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；1200型安捷倫液相色譜（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；55-4型冷凍干燥機(jī)（Scanlaf公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶含量及酶活性測(cè)定[27]

粗酶液的制備：稱(chēng)取茶鮮葉1~3?g，加入少量石英砂和等量的PVPP，在液氮中研磨至粉狀，分裝到預(yù)冷的離心管中，取其中1管加入預(yù)冷的酶提取緩沖液，振蕩渦旋混勻，4℃、12?000?r·min-1離心，取上清液移至新離心管中冰浴，用于酶的含量測(cè)定和酶活性分析。

酶提取緩沖液：50?mmol·L-1Tris-HCI（pH=8.9）、10?μmol·L-1亮抑蛋白酶肽、5?mmol·L-1EDTA、15?mmol·L-1-巰基乙醇、5?mmol·L-1Vc、1?mmol·L-1PMSF、0.15%（∶）的PVPP。

酶含量測(cè)定：采用Bardford法測(cè)定。在3組微量離心管中分別加入0.1?mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（BSA溶液）0、30、60、90、120?μL和150?μL，用酶提取緩沖液將其稀釋到1?000?μL，加入500?μL考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑后振蕩混勻，室溫放置2?min，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)595?nm測(cè)定吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。取酶粗提液樣品10?μL，按照上述方法測(cè)定595?nm吸光度，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出酶粗提液樣品中所含的蛋白質(zhì)濃度。

酶活性分析：采用ELISA試劑盒測(cè)定酶活性。利用酶提取緩沖液將粗酶液濃度稀釋為1?μg·μL-1，置于冰浴上，用于酶的活性分析，測(cè)定步驟如下：從室溫平衡20?min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50?μL；待測(cè)樣本孔先加入待測(cè)樣本10?μL，再加入樣本稀釋液40?μL；隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中分別加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100?μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60?min；棄去液體，于吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1?min去除洗滌液，于吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；每孔加入底物A、B各50?μL，37℃避光孵育15?min；每孔加入終止液50?μL，15?min內(nèi)，在450?nm波長(zhǎng)完成樣品的吸光度測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品的酶活性（U·mL-1）。

1.3.2 花青素含量的測(cè)定[28]

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0?g茶葉磨碎干樣，沸水浸提，過(guò)濾，定容至50?mL作為供試液。吸取2?mL供試液加入8?mL酸性乙醇，顯色30?min，離心后在535?nm下比色測(cè)定。

1.3.3 茶多酚及兒茶素含量測(cè)定[28]

茶多酚含量的測(cè)定采用比色法；兒茶素含量的測(cè)定采用HPLC分析法，色譜柱為安捷倫C18色譜柱（150?mm×4.6?mm）；流動(dòng)相A相：0.05%的磷酸水；B相：乙腈；梯度洗脫，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為45?min，流速為1?mL·min-1，進(jìn)樣量為10?μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為278?nm，柱溫35℃。

1.3.4 茶樹(shù)鮮葉中含水量的測(cè)定[28]

稱(chēng)取5.0?g茶樹(shù)鮮葉樣品，置于120℃烘箱內(nèi)烘干2?h，測(cè)定烘干前后的質(zhì)量差，計(jì)算含水量（%），用于換算花青素及其兒茶素等物質(zhì)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)花青素含量和酚類(lèi)物質(zhì)含量分析

茶樹(shù)鮮葉中花青素含量因季節(jié)和品種不同存在顯著差異。由圖3可知，春夏秋三季綠芽對(duì)照組花青素含量均極顯著低于供試組樣品。紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)的花青素含量春季最低，夏秋季顯著高于春季；而丹妃花青素含量趨勢(shì)為春季含量最高，夏秋顯著減少，與前期研究結(jié)果一致[4]。紫娟鮮葉中花青素含量在夏季最高，秋季次之，春季最低。紅紫芽品種（系）春夏秋三季花青素含量分別是對(duì)照的10.28~23.64倍、6.79~10.88倍和11.07~23.40倍。這與紅紫芽品系芽葉外觀呈紅紫色，而綠芽品種芽葉呈綠色的表型一致[17]。

不同季節(jié)茶樹(shù)鮮葉中茶多酚含量如圖4所示。春夏秋三季對(duì)照組和供試組茶多酚含量存在顯著性差異，其中紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)、丹妃中茶多酚含量顯著高于對(duì)照?？傮w來(lái)說(shuō)，茶樹(shù)鮮葉中茶多酚含量相對(duì)較高，達(dá)到干重的30%以上，除紫娟外，同一品種不同季節(jié)茶多酚的變化規(guī)律與花青素的變化趨勢(shì)基本一致。

兒茶素組分及含量測(cè)定結(jié)果如表1所示。所有樣品中EC、C、GC、CG含量均較低，酯型兒茶素EGCG含量最高，EGC次之。研究表明，紅紫芽茶鮮葉中酯型兒茶素含量高于普通綠芽茶樹(shù)鮮葉[11]，但本研究中的規(guī)律并不明顯。紅葉1號(hào)（4.27%）、紅葉2號(hào)（4.75%）的ECG的含量大于對(duì)照（3.58%），且存在顯著性差異；紫娟（2.47%）和丹妃（2.08%）低于對(duì)照。紫娟中EGC含量春夏兩季顯著高于對(duì)照；紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)及丹妃含量則顯著低于對(duì)照組（紅葉2號(hào)的春季樣品除外）。丹妃和紫娟鮮葉中C和CG含量低于其他兒茶素組分，其中丹妃在春夏秋三季C的平均含量只有0.28%。不同品種中EGCG含量有所差別，在平均含量上對(duì)照組綠芽種鮮葉中C、EC、GC及GCG含量高于供試組樣品；在兒茶素總量上，對(duì)照綠芽種顯著高于供試組，與前期研究結(jié)論一致[13]。本研究中供試組樣品的兒茶素總量低于對(duì)照，可能有兩方面原因：一是兒茶素和花青素共用一條合成途徑，有此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，相同條件下紫芽茶的花青素含量高則兒茶素含量較低[14]；二是對(duì)照種英紅九號(hào)為大葉種茶樹(shù)，自身具有較高的兒茶素含量。

表1 不同品種茶樹(shù)在不同季節(jié)鮮葉的兒茶素組分及含量

注：*表示供試組與對(duì)照同一季節(jié)樣品存在顯著差異（<0.05）

Note: * indicates that there is significant difference between test group and control in the same season (<0.05)

注：**表示供試組與對(duì)照同一季節(jié)樣品存在極顯著差異（P<0.01）

注：*表示供試組與對(duì)照同一季節(jié)樣品存在顯著差異（P<0.05）

2.2 花青素合成代謝關(guān)鍵酶的活性測(cè)定

PAL是苯丙烷代謝途徑第一個(gè)催化酶，催化苯丙氨酸形成肉桂酸進(jìn)入次級(jí)代謝（圖1）。本研究分析了不同季節(jié)紅紫芽茶樹(shù)鮮葉中的PAL酶活性（圖5）。結(jié)果表明，與其他花青素合成代謝的關(guān)鍵酶相比，PAL酶活性最低。整體來(lái)看，夏季PAL活性最低（平均酶活力10?mU·mL-1），除丹妃外，其他3個(gè)供試組紅紫芽品種（系）顯著高于對(duì)照；春季丹妃和紫娟樣品PAL活性顯著低于對(duì)照；大部分樣品秋季PAL活性高于其他季節(jié)，平均酶活力約60?mU·mL-1。

CHS催化形成了茶樹(shù)花青素合成途徑中的第一個(gè)中間產(chǎn)物查兒酮（圖1）。由圖6-A可知，CHS在茶樹(shù)體內(nèi)的活性相對(duì)較高（167~363?mU·mL-1），供試組夏季活性最高（254~362?mU·mL-1），春季和秋季較低，尤其是紫娟，夏季的酶活性最高。紅葉1號(hào)、丹妃及紫娟夏季CHS酶活力均顯著高于對(duì)照。

F3H和DFR的酶活在3個(gè)季節(jié)的變化趨勢(shì)相反（圖6-B、圖6-C），F(xiàn)3H一般在秋季的活性最高，春季最低；而DFR在春季活性最高，秋季最低；且前者的酶活性相對(duì)較大。春季紅紫芽茶鮮葉F3H活性與對(duì)照差異不顯著；夏季大部分紅紫芽茶鮮葉F3H活性顯著低于對(duì)照，而紫娟顯著高于對(duì)照，可能與紫娟夏季鮮葉中高EGC含量有關(guān)；秋季F3H活性紅葉1號(hào)顯著高于對(duì)照，丹妃顯著低于對(duì)照，其他樣品與對(duì)照差異不顯著。

與綠芽品種英紅九號(hào)相比，不同季節(jié)不同紅紫芽品種（系）的DFR酶活性差異較大（圖6-C）：春季紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)酶活顯著高于對(duì)照，而紫娟DFR酶活顯著低于對(duì)照，丹妃與對(duì)照無(wú)顯著差異；夏季紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)、紫娟DFR酶活顯著高于對(duì)照，丹妃與對(duì)照種無(wú)顯著差異；秋季紫娟DFR酶活顯著高于對(duì)照，而紅葉2號(hào)顯著低于對(duì)照，紅葉1號(hào)和丹妃與對(duì)照無(wú)顯著差異。

ANS是將無(wú)色花青素轉(zhuǎn)化為有色花青素的關(guān)鍵酶，不同季節(jié)ANS酶活力變化如圖6-D所示。由圖6可知，ANS酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)中的其他酶活力，整體酶活力范圍在300~400?mU·mL-1，且在不同季節(jié)較穩(wěn)定，不同茶樹(shù)品種每個(gè)季節(jié)變化趨勢(shì)不同。春季，紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)、丹妃的ANS酶活力顯著低于對(duì)照；夏季，紅葉1號(hào)、紫娟ANS酶活力顯著高于對(duì)照，而紅葉2號(hào)顯著低于對(duì)照；秋季，丹妃ANS酶活力顯著高于對(duì)照。

注：*表示供試組與對(duì)照同一季節(jié)樣品存在顯著差異， P<0.05。下同

注：A：查爾酮合成酶；B：類(lèi)黃酮-3-羥化酶；C：二氫黃酮醇-4-還原酶；D：花青素合成酶；E：花青素還原酶；F：類(lèi)黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶

由圖6-E可知，ANR整體酶活力較低，平均酶活力處于54.04~75.81?mU·mL-1。春季樣品中紅葉1號(hào)ANR酶活顯著低于對(duì)照，其他紅紫芽樣品與對(duì)照差異不顯著；夏季樣品中紅葉2號(hào)和紫娟ANR酶活顯著高于對(duì)照，紅葉1號(hào)和丹妃與對(duì)照差異不顯著；秋季樣品ANR酶活力高于其他季節(jié)，其中紫娟酶活力最高，達(dá)到86.75?mU·mL-1，顯著高于對(duì)照，而其他紅紫芽品種（系）與對(duì)照無(wú)顯著差異。

UFGT是花青素合成代謝末端的一類(lèi)酶，最常見(jiàn)的是類(lèi)黃酮3--葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT），它能夠催化糖苷轉(zhuǎn)移，使不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的花青苷。不同季節(jié)UFGT酶活力變化情況如圖6-G所示。春夏秋三季供試組樣品酶活度均顯著高于對(duì)照組（<0.05）。除對(duì)照組外，紅紫芽品種（系）UFGT的活性變化趨勢(shì)一致，均呈現(xiàn)秋季＞夏季＞春季（圖6-G）。

2.3 花青素合成代謝關(guān)鍵酶活性與重要酚類(lèi)物質(zhì)的相關(guān)性

各品種（系）在春、夏、秋三季花青素合成關(guān)鍵酶活性與花青素、茶多酚、兒茶素的相關(guān)性分析如表2所示。PAL酶活性與包括花青素在內(nèi)的大部分酚類(lèi)物質(zhì)含量無(wú)明顯的相關(guān)性，較為特殊的是紅葉1號(hào)和紫娟鮮葉中C含量與PAL酶活性存在顯著的相關(guān)性，前者為正相關(guān)，后者為負(fù)相關(guān)。除丹妃外，其他品種（系）鮮葉中PAL酶活力都與鮮葉中EGCG含量有正向相關(guān)性，但未達(dá)到顯著水平。

CHS酶活力與對(duì)照樣品英紅九號(hào)的花青素含量顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999，而與紅紫芽品種（系）花青素含量不存在顯著相關(guān)性。紅紫芽品種（系）鮮葉的EGC、ECG、GC、CG含量與CHS酶活性均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其中紫娟的CG含量與CHS酶活性的相關(guān)性達(dá)顯著水平。丹妃的EGCG含量與CHS酶活力有正相關(guān)的趨勢(shì)，但不顯著，其余樣品均呈負(fù)相關(guān)，其中對(duì)照樣品英紅九號(hào)鮮葉中EGCG含量與CHS酶活力呈顯著負(fù)相關(guān)。

F3H酶活力與紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)和紫娟3個(gè)紅紫芽茶鮮葉的花青素含量存在一定的正相關(guān)性，而與丹妃花青素含量呈負(fù)相關(guān)，但均不顯著。丹妃鮮葉F3H酶活性與茶多酚含量顯著負(fù)相關(guān)。F3H酶活力與兒茶素各組分均沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

DFR酶活性與丹妃花青素含量有一定的正相關(guān)性，與其他參試樣品花青素含量呈負(fù)相關(guān)，但均未達(dá)到顯著水平，而與丹妃的茶多酚含量呈顯著正相關(guān)。各品種（系）中DFR酶活性與兒茶素組分無(wú)明顯相關(guān)性。

除紫娟外，ANS酶活性與花青素含量整體呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。丹妃鮮葉中花青素和CG的含量與ANS酶濃度活性有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均為–1.000。不同季節(jié)的ANR酶活力與其他酚類(lèi)物質(zhì)含量無(wú)明顯的相關(guān)性。

紅葉1號(hào)、紅葉2號(hào)茶鮮葉在春夏秋三季的UFGT活性變化與花青素含量有顯著的正相關(guān)，而丹妃的UFGT活性則與其存在顯著的負(fù)相關(guān)，對(duì)照英紅九號(hào)和紫娟UFGT活性與其無(wú)顯著正相關(guān)性。此外，丹妃和紅葉2號(hào)的UFGT活性分別與CG含量和GC含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

同時(shí)，通過(guò)對(duì)同一季節(jié)的兩組樣品花青素合成關(guān)鍵酶與重要酚類(lèi)物質(zhì)含量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表3），春季所有樣品茶多酚含量與UFGT酶活性存在顯著正相關(guān)，C的含量與PAL酶活性顯著正相關(guān)，ECG的含量與DFR酶活性存在顯著正相關(guān)；春、夏、秋三季UFGT酶活性與所有樣品鮮葉中花青素的含量都有顯著的正相關(guān)性，春季UFGT酶活性與茶多酚總量顯著正相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

茶樹(shù)體內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)含量受品種遺傳和外界環(huán)境的雙重影響[16]。本研究中，常規(guī)綠芽品種對(duì)照組和紅紫芽品種（系）供試組茶多酚含量存在顯著差異，但并非紫芽品種（系）茶多酚含量均大于對(duì)照；而紅紫芽茶鮮葉中花青素含量極顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照品種的6.79~23.64倍，這與紫芽品種（系）芽葉呈紅紫色，綠芽品種芽葉呈綠色或黃綠色的表型是一致的?；ㄇ嗨睾铣纱x關(guān)鍵酶活性與各兒茶素組分的顯著性差異分析表明，對(duì)照組和供試組樣品無(wú)一致規(guī)律性。春季不同品種（系）C含量與PAL酶活性顯著正相關(guān)，ECG含量與DFR酶活性顯著正相關(guān)，茶多酚總量與UFGT酶活性正相關(guān)；春夏秋三季CHS、F3H、ANS以及ANR酶活性與兒茶素組分無(wú)顯著相關(guān)性?？傮w來(lái)說(shuō)，受遺傳決定因素的限制，供試組和對(duì)照組因茶樹(shù)品種的差異性，導(dǎo)致其體內(nèi)多酚類(lèi)物質(zhì)的合成代謝存在一定差別，因此不適于在兩組之間進(jìn)行比較；而對(duì)于同一茶樹(shù)品種（系）來(lái)說(shuō)，其體內(nèi)的多酚在合成時(shí)會(huì)受到季節(jié)環(huán)境因素影響，從而導(dǎo)致其合成量的改變，體內(nèi)的花青素含量也隨之變化。

表2 不同茶樹(shù)品種的花青素合成關(guān)鍵酶活性與酚類(lèi)物質(zhì)含量相關(guān)系數(shù)

注：*表示該成分與花青素合成相關(guān)酶活性呈顯著相關(guān)性，<0.05。下同

Note: * indicates that there is a significant correlation between this component and enzyme activity involving in anthocyanin synthesis,<0.05. The same below

續(xù)表2

表3 不同季節(jié)的茶樹(shù)花青素合成關(guān)鍵酶活性與酚類(lèi)物質(zhì)含量的相關(guān)系數(shù)

花青素合成關(guān)鍵酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，PAL、ANR等酶活性相對(duì)較低，ANS、CHS的酶活性較高，其中ANS活性最高且比較穩(wěn)定，在不同的品種（系）及季節(jié)波動(dòng)性較??；不同季節(jié)茶樹(shù)鮮葉PAL、CHS、F3H、FLS、ANS、ANR等酶活性變化趨勢(shì)與花青素含量變化無(wú)顯著的相關(guān)性，供試組和對(duì)照組的各個(gè)酚類(lèi)組分的含量與F3H和DFR的相關(guān)性呈現(xiàn)大致相反的趨勢(shì)，但相關(guān)性均不顯著，可能與樣本數(shù)量較少有關(guān)。本次試驗(yàn)所選的綠芽對(duì)照品種（英紅九號(hào)）茶多酚及兒茶素含量都相對(duì)較高，而茶樹(shù)體內(nèi)花青苷的合成途徑又是類(lèi)黃酮合成途徑的分支，所涉及酶類(lèi)不僅參與花青素的合成，而且大部分會(huì)參與到包括兒茶素在內(nèi)的其他類(lèi)黃酮物質(zhì)的合成，因而導(dǎo)致大部分的酶活性與花青苷或兒茶素等無(wú)明顯的相關(guān)性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，同一季節(jié)UFGT酶活性在供試組及對(duì)照組之間存在顯著差異，UFGT酶活性與同一季節(jié)不同品種（系）中花青素含量呈正相關(guān)。UFGT是紅紫芽茶花青素合成過(guò)程的關(guān)鍵酶，為茶葉中酚類(lèi)物質(zhì)的組成提供了一定生化動(dòng)力，進(jìn)而影響著紅紫芽茶的主要理化成分。但由于茶樹(shù)UFGT家族包含大量基因，它們的功能不同，具體哪些基因是花青素合成的關(guān)鍵基因仍需要深入研究。各品種（系）花青素含量的季節(jié)性變化趨勢(shì)與UFGT酶活性相關(guān)性不一致，紅葉品種（系）與其呈顯著正相關(guān)，而紫葉的丹妃與其呈顯著負(fù)相關(guān)，紫娟與其無(wú)顯著相關(guān)性（表2）。UFGT酶活性在不同品種（系）中季節(jié)性的差異表現(xiàn)，可能是因?yàn)椴煌钠贩N（系）體內(nèi)花青苷的組分不同，而由于本研究測(cè)定的UFGT是對(duì)類(lèi)黃酮類(lèi)的3位進(jìn)行糖基化，如果酶體內(nèi)主要的花青苷組分是甲基化、?；ㄇ嗨鼗?位糖基化等，那么該酶的活性變化趨勢(shì)可能會(huì)與其體內(nèi)花青苷的含量變化趨勢(shì)有所偏差[29]。因此針對(duì)不同的茶樹(shù)品種（系），其所含花青苷組分的差異可能導(dǎo)致UFGT酶活性的差異，后期還需對(duì)這些品種（系）中關(guān)鍵的UFGT進(jìn)一步鑒定。此外，對(duì)花青素的修飾，除葡萄糖糖苷化作用外，對(duì)鼠李糖、阿拉伯糖等糖苷修飾酶的修飾作用，以及?；图谆傅男揎椬饔?，也有待進(jìn)一步研究分析，以獲得對(duì)紫芽茶花青苷合成機(jī)理更加全面的了解。

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Study on the Correlation between the Activities of Key Enzymes Involving in Anthocyanin Synthesis and the Contents of Important Polyphenols in Purple Tea

CAO Bingbing1,2, WANG Qiushuang1*, QIN Dandan1, FU Donghe2, FANG Kaixing1, JIANG Xiaohui1, LI Hongjian1, WANG Qing1, PAN Chendong1, LI Bo1, WU Hualing1*

1. Tea Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Key Laboratory of Tea Plant Resources Innovation & Utilization Resources Innovation and Utilization, Guangzhou 510640, China; 2. Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

In this study, four purple tea cultivars (strains) namely Hongye 1, Hongye 2, Danfei from Guangdong and Zijuan from Yunnan were used as the testing materials. Yinghong 9 with green buds was used as the control. The activity changing patterns of the key enzymes involved in anthocyanin synthesis were studied by the enzyme activities analysis, which revealed the relationship between the enzyme activities and biochemical components in tea. The results show that the activity of flavonoid-3--glycosyltransferase (UFGT), a key enzyme involved in anthocyanin synthesis, was positively correlated with the total amount of tea polyphenols and the anthocyanin contents in different samples in the same season. However, the activities of phenylalanine ammonia lyase (PAL), chalcone synthase (CHS), flavonoid-3-hydroxylase (F3H), dihydroflavonol-4-reductase (DFR), flavonol synthase (FLS), anthocyanin synthase (ANS) and anthocyanin reductase (ANR) were not significantly correlated with the anthocyanin contents. There was a significant and positive correlation between catechin (C) content and PAL enzyme activity in spring. Epicatechin gallate (ECG) content and DFR enzyme activity showed the same result. In addition, there was no significant correlation between the activities of CHS, F3H, ANS and ANR enzymes and polyphenols contents in different cultivars (strains) in the same season.

purple tea, anthocyanin, enzyme, polyphenols

S571.1

A

1000-369X(2020)06-724-15

2020-03-03

2020-04-07

廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃（2020B020220004）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-19）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31600550）、科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專(zhuān)項(xiàng)資金（201619TD、R2016YJ-YB3002、R2017PY-QY009、R2018QD-100）

曹冰冰，女，碩士，主要從事茶樹(shù)育種研究，bbc@163.com。*通信作者：wqsh1113@163.com；wuhualing@163.com