任倩倩，莊明珠，蔡曉明，邊磊，羅宗秀，李兆群，尤民生，陳宗懋*，金珊*

小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)抗、感茶樹品種揮發(fā)物的釋放

任倩倩1，莊明珠1，蔡曉明2，邊磊2，羅宗秀2，李兆群2，尤民生3，陳宗懋2*，金珊1*

1. 茶學(xué)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3. 應(yīng)用生態(tài)研究所，福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002

為研究不同抗性水平茶樹應(yīng)對(duì)小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)的揮發(fā)物釋放及相關(guān)代謝機(jī)制，以抗蟲茶樹品種舉巖（JY）和感蟲茶樹品種恩標(biāo)（EB）為試驗(yàn)材料，利用動(dòng)態(tài)頂空收集法結(jié)合GC-MS技術(shù)檢測(cè)茶樹在小貫小綠葉蟬取食不同時(shí)間（6、12、24、36、48、72?h）釋放的主要揮發(fā)物組分，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析主要揮發(fā)物合成途徑上的相關(guān)基因的表達(dá)水平及其調(diào)控趨勢(shì)。結(jié)果表明，在健康狀態(tài)下，茶樹釋放的揮發(fā)性物質(zhì)較少；在蟲害后不同時(shí)間段的茶樣中檢測(cè)到順--羅勒烯（-Ocimene）、()-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯[()-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene，DMNT]、芳樟醇（Linalool）、法尼烯（Farnesene）等10種主要揮發(fā)物。其中，單萜類物質(zhì)在蟲害誘導(dǎo)的感蟲品種茶樹上含量高，倍半萜類物質(zhì)在蟲害誘導(dǎo)的抗蟲品種茶樹中含量高。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)抗、感茶樹品種中調(diào)控萜類合成的關(guān)鍵基因均被明顯激活。調(diào)控單萜類物質(zhì)合成的相關(guān)基因在感蟲茶樹品種中的表達(dá)量相對(duì)較高，而調(diào)控倍半萜類物質(zhì)合成的相關(guān)基因在抗蟲品種中的表達(dá)量與感蟲品種差異不顯著。本研究結(jié)果為茶樹抗蟲機(jī)制和小貫小綠葉蟬綠色防控提供一定的理論依據(jù)。

茶樹；揮發(fā)物；小貫小綠葉蟬；萜類物質(zhì)；基因調(diào)控

植物揮發(fā)物是通過(guò)體內(nèi)次生代謝途徑合成的揮發(fā)性有機(jī)化合物，主要包括綠葉揮發(fā)物（Green leaves volatiles，GLVs）、萜烯類化合物、苯丙素類化合物及其他。當(dāng)植物受到蟲害時(shí)，會(huì)產(chǎn)生并釋放誘導(dǎo)揮發(fā)物，以此來(lái)抑制昆蟲為害或吸引天敵[1-3]。

小貫小綠葉蟬[(Matsuda)]，半翅目，葉蟬科，是我國(guó)茶樹（(L.) O. Kuntze）上為害嚴(yán)重的刺吸式害蟲[4-5]。其若蟲和成蟲以刺吸茶樹嫩芽葉中的汁液為食，成年雌蟲產(chǎn)卵于茶樹嫩莖和葉肉組織里。早期為害會(huì)致使茶葉枯黃、葉面卷曲，嚴(yán)重為害時(shí)會(huì)導(dǎo)致葉面褐變、枯萎，致使葉片掉落[6]。目前，生產(chǎn)上對(duì)葉蟬最有效的防控手段仍然是化學(xué)防控，但小貫小綠葉蟬對(duì)幾種主要?dú)⑾x劑均具有抗性[7]，且過(guò)量使用殺蟲劑會(huì)導(dǎo)致茶葉中的農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問(wèn)題。因此，發(fā)掘并利用茶樹的品種抗性，是促進(jìn)茶園綠色防控體系構(gòu)建的重要途徑。目前對(duì)小貫小綠葉蟬誘導(dǎo)茶樹揮發(fā)物的研究已經(jīng)有很多，但針對(duì)小貫小綠葉蟬取食后抗、感茶樹釋放的揮發(fā)物的差異及相關(guān)基因調(diào)控的研究尚不多見(jiàn)。

本研究比較分析了小貫小綠葉蟬取食危害后抗、感茶樹揮發(fā)物在組成、含量和釋放時(shí)間上的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)比兩個(gè)品種上相關(guān)基因表達(dá)量的差異，初步探明抗蟲和感蟲茶樹品種應(yīng)對(duì)小貫小綠葉蟬危害的揮發(fā)物釋放規(guī)律及相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步為茶樹抗蟲機(jī)制、茶樹-害蟲-天敵三級(jí)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系的互作機(jī)制提供一定的理論支撐，也為小貫小綠葉蟬綜合防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和蟲源

試驗(yàn)材料為高抗茶樹品種舉巖（簡(jiǎn)稱“JY”）和感蟲茶樹品種恩標(biāo)（簡(jiǎn)稱“EB”）[8]的2年生扦插苗。茶樹種植于浙江省杭州市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所內(nèi)國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹圃（30°10′N，120°05′E）。將2年生健康的、有兩個(gè)幼嫩新梢的無(wú)性系盆栽茶苗，栽培于溫度為(25±2)℃，相對(duì)濕度為70%±5%，光周期為14?h/10?h的無(wú)蟲害的多功能日光溫室。在非試驗(yàn)期間用100目網(wǎng)紗籠罩，以防止蟲害。試驗(yàn)選用長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的健康茶苗。

小貫小綠葉蟬成蟲（杭州種群）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供，放置于溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度70%±5%，光照與黑暗之比為14?h/10?h的多功能養(yǎng)蟲室，用新鮮茶枝飼養(yǎng)，繁衍3代以上。供試?yán)ハx為3齡若蟲，試驗(yàn)前饑餓2?h。

1.2 試驗(yàn)處理

在每盆供試茶樹的新梢放置30頭小貫小綠葉蟬，將離土面5?cm主桿以上都用PET（Polythylene terephthalate）塑料袋罩住并系緊，防止小貫小綠葉蟬逃逸，最后將對(duì)照和接蟲茶苗接入揮發(fā)物收集系統(tǒng)。以小貫小綠葉蟬持續(xù)取食危害6、12、24、36、48?h和72?h后作為蟲害處理組，以無(wú)蟲害的健康茶苗作為空白對(duì)照組，各設(shè)置3次重復(fù)。揮發(fā)物收集裝置如圖1所示。

圖1 茶樹揮發(fā)物收集裝置

采用動(dòng)態(tài)頂空收集法收集揮發(fā)物[9-12]。使用PET塑料采樣袋（35?cm×43?cm）套在供試茶樹上收集揮發(fā)物。PET采樣袋下開口處接入一根帶有活性炭（置于100℃烘箱活化4?h）的硅膠管，在茶樹莖與PET塑料袋的銜接處用棉花包裹，以免對(duì)植物造成機(jī)械損傷，用膠帶和細(xì)鐵絲將下面扎緊；在袋子的上面開口并連接帶有漏斗的出氣管（硅膠管），用Teflon管接填充有30?mg的Super-Q吸附柱（Alltech Associates，Deerfield，IL，USA）中，進(jìn)行吸附收集。進(jìn)、出氣管均連接到大氣采樣儀上，進(jìn)氣口空氣經(jīng)活性炭過(guò)濾后泵入采樣袋中。收集前用大氣采樣儀（QC-1B，北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所）將袋中空氣抽盡，后經(jīng)活性炭泵入新鮮空氣，再進(jìn)行循環(huán)。進(jìn)氣口氣體流量為1?048?mL·min-1，出氣口流量為840?mL·min-1，收集時(shí)間為4?h，采樣時(shí)室內(nèi)溫度為(25±2)℃，空氣濕度為75%±5%。

揮發(fā)物收集完成后，將吸附柱取下，使用500?μL二氯甲烷（色譜級(jí)，Sigma公司）分3次淋洗吸附柱中收集到的茶樹揮發(fā)物，將洗脫液置于1.5?mL進(jìn)樣瓶（安捷倫）。在樣品瓶中加入0.05?μg癸酸乙酯（色譜級(jí)，Sigma公司）作為內(nèi)標(biāo)（IS），–20℃保存。

1.3 揮發(fā)物的GC-MS檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

待測(cè)揮發(fā)物進(jìn)行分析鑒定方法：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）（型號(hào)：7890B-5977B，安捷倫公司，美國(guó)）。色譜條件：45℃保持2?min，以5℃·min-1升至210℃，以25℃·min-1升至240℃保持10?min。色譜柱為DB-23（長(zhǎng)30?m，內(nèi)徑0.25?mm，膜厚0.25?μm）；載氣為氦氣（純度為99.999%），流速為1?mL·min-1；進(jìn)樣口溫度220℃，采用分流比進(jìn)樣模式，1∶10分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1?μL。采用EI電離方式，電子能量70?eV，離子源溫度220℃，采集方式為全掃描。

揮發(fā)物物質(zhì)的定性方法：（1）樣品各組分與其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化合物在GC-MS色譜圖上保留時(shí)間的吻合度；（2）樣品組分的質(zhì)譜峰與NIST 14.0（National Institute of Standards and Technology）質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配度（>90）；（3）相關(guān)的茶葉揮發(fā)物文獻(xiàn)[10-14]；確定各組分峰化學(xué)成分。以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，即根據(jù)總離子流色譜圖（TIC）中各組分峰面積值與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，作為該化合物在茶樹中的相對(duì)含量，即：各組分釋放量（相對(duì)含量）=揮發(fā)物物質(zhì)峰面積/癸酸乙酯峰面積。

1.4 揮發(fā)物合成相關(guān)基因表達(dá)量分析

為了進(jìn)一步闡明小貫小綠葉蟬取食為害誘導(dǎo)防御中揮發(fā)物的生物合成途徑及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，結(jié)合他人相關(guān)領(lǐng)域的研究結(jié)果[11]，從小貫小綠葉蟬取食為害3個(gè)不同時(shí)期（6、12、24?h）的抗、感茶樹轉(zhuǎn)錄組中[15]，挖掘揮發(fā)物合成代謝網(wǎng)絡(luò)中的差異基因，并以熱圖的形式比較分析了兩個(gè)茶樹品種在蟲害不同時(shí)間點(diǎn)，揮發(fā)物合成途徑上相關(guān)基因的表達(dá)量變化。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)是從本課題組前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)定的結(jié)果中挖掘得到[15]。該轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)的供試材料（JY和EB）、供試?yán)ハx（小貫小綠葉蟬，每個(gè)重復(fù)30頭）、處理方法（為害0、6、12、24?h，每個(gè)處理3次重復(fù)）均與本研究相同。分別采摘小貫小綠葉蟬為害0、6、12、24?h新梢的一芽二葉，立即投入液氮中速凍，后放入–80℃冰箱保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)錄組測(cè)定的方法、驗(yàn)證方法和數(shù)據(jù)處理方法詳見(jiàn)Jin等[15]的報(bào)道。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理與分析。使用GraphPad Prism 7進(jìn)行茶樹揮發(fā)物含量動(dòng)態(tài)變化的繪制，使用TBtools軟件對(duì)萜類合成相關(guān)基因制成熱圖[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)抗、感茶樹品種揮發(fā)物變化

小貫小綠葉蟬刺吸茶樹嫩梢，會(huì)導(dǎo)致茶樹揮發(fā)物發(fā)生變化。與健康茶樹相比，蟲害不僅能誘導(dǎo)茶樹釋放出新的化合物，而且也會(huì)使某些化合物的釋放量增加。

采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析小貫小綠葉蟬取食為害后抗、感茶樹品種釋放的揮發(fā)物物質(zhì)，各組分經(jīng)NIST 14.0質(zhì)譜圖庫(kù)比對(duì)分析結(jié)果顯示，最終得到順-3-乙烯酯、順--羅勒烯、芳樟醇、()-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、水楊酸甲酯、石竹烯、-法尼烯、(E,E)-4,8,12-三甲基-1,3,7,11-十三碳四烯等10種主要化合物（表1）。

前期研究表明，害蟲為害的植株通過(guò)釋放的揮發(fā)物吸引天敵來(lái)抑制害蟲的數(shù)量。其中吸引天敵的主要成分有單萜或倍半萜，如芳樟醇、月桂烯、苧烯、法尼烯、沒(méi)藥烯以及吲哚等[17-20]。本研究中單萜類化合物主要包括：-羅勒烯、芳樟醇、石竹烯；倍半萜烯類化合物：DMNT、()--法尼烯、TMTT。由于結(jié)果中TMTT的釋放量較為微量，此處不作統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明（圖2），在小貫小綠葉蟬取食后6?h，單萜類和倍半萜烯類揮發(fā)物的釋放量在兩個(gè)茶樹品種上并沒(méi)有顯著增加；在小貫小綠葉蟬持續(xù)危害至24?h后，單萜類和倍半萜類物質(zhì)在茶樹中釋放量顯著增加；隨著危害時(shí)間的延長(zhǎng)，兩類揮發(fā)物的釋放量在兩個(gè)品種上呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)。感蟲品種EB，在小貫小綠葉蟬危害24?h后，釋放了大量的單萜類物質(zhì)，其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同時(shí)間段（36、48、72?h）的抗蟲品種JY。而且，其單萜類物質(zhì)含量隨蟲害時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在72?h時(shí)達(dá)到最大值。與感蟲茶樹品種不同，抗蟲茶樹JY釋放的單萜類物質(zhì)相對(duì)含量呈現(xiàn)波浪形，且在被葉蟬危害后48?h的釋放量最大。與單萜類物質(zhì)在兩個(gè)品種上的釋放規(guī)律不同，被小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)后，倍半萜類物質(zhì)在抗蟲品種JY上的釋放量在48?h前要高于感蟲品種EB。抗蟲品種JY在蟲害誘導(dǎo)12、24、36、48?h的倍半萜類物質(zhì)的釋放量顯著高于感蟲品種EB，且在24?h和48?h達(dá)到兩個(gè)釋放高峰（48?h時(shí)的釋放量略高于24?h），至72?h時(shí)，JY的倍半萜類物質(zhì)釋放量又明顯降低；感蟲品種EB在蟲害誘導(dǎo)36?h后，大量釋放倍半萜類物質(zhì)，到72?h達(dá)到最高峰，甚至超過(guò)EB在24?h和48?h的釋放量。

表1 小貫小綠葉蟬取食危害后茶樹釋放主要揮發(fā)物成分

總體來(lái)看，兩個(gè)品種的茶樹被小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)后，均釋放出較多的單萜類物質(zhì)和倍半萜類物質(zhì)，這種釋放量的增加在小貫小綠葉蟬持續(xù)取食12?h后開始顯現(xiàn)。從72?h的調(diào)查結(jié)果看，感蟲品種受蟲害誘導(dǎo)釋放更多的單萜類物質(zhì)，抗蟲品種受蟲害誘導(dǎo)釋放更多的倍半萜類化合物。

圖2 葉蟬不同取食時(shí)間處理下茶樹主要揮發(fā)物類別及其含量

2.2 茶樹主要揮發(fā)物的定量分析

采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算這10種主要揮發(fā)物的相對(duì)釋放量，結(jié)果顯示，大部分蟲害處理的揮發(fā)性物質(zhì)相比對(duì)照有所增加（圖3）。由于TMTT的釋放量較為微量，我們這里不作統(tǒng)計(jì)，將其他的9種揮發(fā)物在JY、EB中進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在健康茶樹中，僅存在少量的綠葉揮發(fā)物——順-3-乙烯酯。在小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)后，順-3-乙烯酯釋放量增加，茶樹開始釋放-羅勒烯、芳樟醇、DMNT和-法尼烯等新化合物，且隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)，整體呈現(xiàn)規(guī)律性上升趨勢(shì)。除芳樟醇在蟲害后兩個(gè)茶樹品種的含量變化趨勢(shì)相同外，其余揮發(fā)物釋放趨勢(shì)均存在差異。在蟲害6?h時(shí)，綠葉揮發(fā)物順-3-己烯酯開始釋放，但隨蟲害時(shí)間延長(zhǎng)，JY的綠葉揮發(fā)物的釋放量逐漸降低，EB在36?h時(shí)又再次出現(xiàn)釋放量高峰；()--羅勒烯在EB中的釋放量相對(duì)較高，同樣在36?h達(dá)到最大量；()-羅勒烯隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步增加，EB的含量比JY相對(duì)較高，在72?h時(shí)JY的釋放量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在抗蟲茶樹品種JY和感蟲茶樹品種EB的揮發(fā)物種類大致是相同的，感蟲茶樹品種EB的揮發(fā)物釋放量相對(duì)較大。

2.3 揮發(fā)物合成相關(guān)基因

對(duì)抗、感茶樹品種上合成GLVs的-亞麻酸途徑的關(guān)鍵基因：、、、等；合成萜烯類化合物的類異戊二烯途徑的關(guān)鍵基因：、、、等；二萜生物途徑的關(guān)鍵基因：、、等；泛醌類途徑：、、等在蟲害不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行分析（圖4）。

通過(guò)揮發(fā)物合成相關(guān)基因的聚類分析，我們看出抗、感茶樹品種在小貫小綠葉蟬取食6?h后僅有部分基因被激活，表達(dá)量明顯上調(diào)；而在蟲害12?h和24?h的萜類合成相關(guān)基因顯著上調(diào)的基因數(shù)量明顯增多，且在小貫小綠葉蟬取食12?h達(dá)到最大量。說(shuō)明隨著小貫小綠葉蟬取食時(shí)間的延長(zhǎng)，茶樹激活調(diào)控萜類合成的基因表達(dá)量有所升高，但也有部分基因表達(dá)被抑制。萜類合成相關(guān)基因表達(dá)量在抗蟲茶樹品種JY和感蟲茶樹品種EB中存在一定差異性。結(jié)果顯示，JY在小貫小綠葉蟬取食后大部分基因在12?h被激活，并持續(xù)至24?h；但EB茶樹大部分基因在12?h時(shí)被激活，但24?h基因表達(dá)被部分抑制。在抗蟲茶樹品種JY中，基因在小貫小綠葉蟬取食6?h和12?h時(shí)相對(duì)表達(dá)量分別約為對(duì)照組的1.5倍和1.15倍，雖然在24?h后表達(dá)受抑制，但比對(duì)照組要高出0.5倍左右。、、基因在小貫小綠葉蟬取食12?h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，表達(dá)量分別約為對(duì)照組的2倍、2.9倍和1.9倍，在12?h和24?h時(shí)達(dá)到峰值，最大表達(dá)量峰值約為對(duì)照組7倍，隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在感蟲茶樹品種EB中，在小貫小綠葉蟬取食6?h和12?h時(shí)表達(dá)量為最大值，分別高出對(duì)照組6.7倍和7倍左右。、、、、在小貫小綠葉蟬取食12?h表達(dá)量達(dá)到峰值，高出對(duì)照組分別為3、3、2.4、2.4倍。因此，茶樹在小貫小綠葉蟬取食12?h后萜類相關(guān)基因被明顯激活，且達(dá)到最大表達(dá)量；萜類合成基因在JY中12?h顯著上調(diào)，且持續(xù)至24?h；而在EB中只有12?h時(shí)表達(dá)量顯著增加，但在24?h時(shí)表達(dá)量有所下降。

圖3 葉蟬取食誘導(dǎo)茶樹主要揮發(fā)物含量的動(dòng)態(tài)變化

圖4 揮發(fā)物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

從基因表達(dá)熱圖中，在蟲害6?h后，感蟲茶樹品種EB有較多的萜類相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而抗蟲茶樹品種JY上調(diào)基因數(shù)量稍低于EB；在蟲害12?h，揮發(fā)物形成相關(guān)基因上調(diào)數(shù)量達(dá)到最大，且持續(xù)至24?h。單萜類物質(zhì)合成相關(guān)基因、、、、在EB中的表達(dá)量相對(duì)較高。而調(diào)控倍半萜類物質(zhì)合成的、、在JY中的表達(dá)量與EB差異不明顯。調(diào)控萜類合成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量在蟲害后明顯增加。

3 討論

健康植株會(huì)自主釋放一些揮發(fā)性物質(zhì)，在遭受植食性昆蟲取食為害后，植物會(huì)啟動(dòng)防御機(jī)制，改變其揮發(fā)物釋放，有利于吸引天敵或趨避害蟲[21-24]。植物大部分損傷誘導(dǎo)防御反應(yīng)出現(xiàn)在為害后的一段時(shí)間段內(nèi)[25]，反應(yīng)過(guò)程包括損傷產(chǎn)生、特別信號(hào)的產(chǎn)生、感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步激活植物防御相關(guān)基因。由-亞麻酸途徑合成的綠葉揮發(fā)物是植物自身的組成型揮發(fā)物，在損傷后即開始釋放；由類異戊二烯途徑合成的萜類化合物是HIPVs中的主要組成成分，在植物-昆蟲的相互作用和間接防御中發(fā)揮重要信號(hào)物質(zhì)的作用[26-29]。

前人對(duì)小貫小綠葉蟬取食后的茶樹揮發(fā)物的研究很多[10-11,14,30-33]。研究結(jié)果表明，在小貫小綠葉蟬取食后，主要揮發(fā)物可以分成脂肪酸衍生物、萜烯類化合物、氨基酸衍生物三類，包括順-3-己烯醇、順-3-己烯酯、羅勒烯、芳樟醇、DMNT、石竹烯、法尼烯、TMTT、橙花叔醇、苯乙腈、水楊酸甲酯、吲哚等物質(zhì)，且這些物質(zhì)除綠葉揮發(fā)物外，其他物質(zhì)的含量都在小貫小綠葉蟬取食為害后誘導(dǎo)激活。本研究結(jié)果表明，小貫小綠葉蟬的取食為害顯著促進(jìn)了抗蟲茶樹品種和感蟲茶樹品種蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物尤其是萜烯類化合物的釋放，但在2個(gè)品種的各化合物的相對(duì)含量存在較大差異?？瓜x茶樹品種JY的倍半萜烯類化合物DMNT、法尼烯含量均高于感蟲茶樹品種EB，但JY的單萜類化合物羅勒烯和芳樟醇含量卻低于EB。Li等[34]、劉丹鳳[35]研究表明，倍半萜烯類化合物DMNT和TMTT是一類重要的防御性物質(zhì)，其前體存在于大部分的植物中。植物受到害蟲危害后，釋放DMNT和TMTT吸引害蟲寄生蜂，對(duì)害蟲起到重要的間接防御作用。趙冬香等[36]研究表明，DMNT對(duì)小貫小綠葉蟬具有輕微排斥作用，且DMNT對(duì)小貫小綠葉蟬的天敵——白斑獵蛛具有較強(qiáng)的引誘作用。另外，王夢(mèng)馨[37]研究發(fā)現(xiàn)，倍半萜烯類化合物-法尼烯對(duì)小貫小綠葉蟬寄生類天敵三棒纓小蜂和微小裂骨小蜂具有很強(qiáng)的引誘力，夏秋兩季在不同地區(qū)分別使用多種蟬害茶梢揮發(fā)物誘集這兩種纓小蜂，均以-法尼烯效果最好。因此，倍半萜類物質(zhì)具有直接抗蟲作用和較強(qiáng)的間接抗蟲作用，蟲害誘導(dǎo)后抗蟲品種JY能釋放出更多該類物質(zhì)，這可能是田間JY上小貫小綠葉蟬蟲口數(shù)量顯著低于感蟲品種EB的原因之一。另一方面，單萜類化合物-羅勒烯也與植物的抗性相關(guān)。研究表明，植物受食草動(dòng)物取食及病原菌感染后，自身釋放的羅勒烯具有提高植物防御能力的作用；植物經(jīng)羅勒烯處理后，能誘導(dǎo)植物啟動(dòng)一系列防御機(jī)制，提高植物的防御能力，使植物對(duì)外界環(huán)境具有更好的適應(yīng)性[39]。但是，害蟲為害植物誘導(dǎo)的-羅勒烯和芳樟醇也能吸引同種類害蟲選擇該寄主為害[38]。此外，芳樟醇的釋放與植物抗蟲性的研究較少，茶樹上僅有少量報(bào)道[32,39]，而且這些報(bào)道僅聚焦茶尺蠖和茶麗紋象甲等昆蟲的取食誘導(dǎo)。但是芳樟醇在農(nóng)產(chǎn)品良好香氣品質(zhì)形成中的作用得到了大量的研究。

蟲害能夠激活茶樹防御相關(guān)基因表達(dá)，抑制消減雜交分析小貫小綠葉蟬為害茶樹葉片，發(fā)現(xiàn)病程相關(guān)基因及次生代謝相關(guān)基因顯著上調(diào)[40-41]。、、是萜類合成途徑中MVA途徑中重要的限速酶基因，調(diào)控著異戊烯基二磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）在細(xì)胞質(zhì)中合成倍半萜烯類物質(zhì)。、、、是萜類合成途徑中MEP途徑中的關(guān)鍵酶，調(diào)控IPP和DMAPP在質(zhì)體中合成單萜類和雙萜類物質(zhì)，其表達(dá)量與MVA途徑中的基因表達(dá)變化一致。萜類合成酶（Terpene synthase，TPS）作為各種萜烯類化合物合成的關(guān)鍵酶類，處在萜類物質(zhì)合成途徑的下游，催化不同萜類化合物的合成[42-44]，如石竹烯、法尼烯和DMNT等，在吸引天敵方面起著重要作用[45-47]。茶樹釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的合成過(guò)程所涉及的代謝途徑較復(fù)雜，對(duì)萜烯類化合物的合成相關(guān)基因調(diào)控分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控單萜、二萜類合成的MEP途徑的關(guān)鍵基因?yàn)?、、、、，其表達(dá)量在EB中高于JY，而羅勒烯和芳樟醇的總釋放量在EB中也高于JY，與其基因表達(dá)規(guī)律一致。在JY和EB中表達(dá)量較高，在12?h、24?h時(shí)的表達(dá)量約為空白對(duì)照組的7倍。這與萜烯類揮發(fā)物的含量在蟲害后變化較大情況一致。但調(diào)控萜類相關(guān)基因在EB中表達(dá)量均相對(duì)較高，在揮發(fā)物測(cè)定時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)EB茶樹揮發(fā)物釋放量也偏大，這可能與茶樹自身的組成型差異相關(guān)。后期我們將進(jìn)一步篩選萜類合成相關(guān)的關(guān)鍵基因，對(duì)茶樹揮發(fā)物進(jìn)行及參與抗逆反應(yīng)的分子機(jī)制也需進(jìn)一步的研究，進(jìn)而探索其潛在功能。

針對(duì)小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)的揮發(fā)物的釋放，室內(nèi)研究較多，而大田試驗(yàn)方面的研究相對(duì)較少。室內(nèi)環(huán)境易操控，重復(fù)性好，但其研究環(huán)境與自然界真實(shí)的田間情況存在較大差異。Cai等[48]建立了熱脫附GC-MS技術(shù)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)茶園環(huán)境空氣中微量揮發(fā)性物質(zhì)的收集和測(cè)定，我們對(duì)該方法進(jìn)行了改造并嘗試，雖然可以獲得大量數(shù)據(jù)，但重復(fù)性未達(dá)理想效果，仍需繼續(xù)探索。后期，我們會(huì)針對(duì)小貫小綠葉蟬取食誘導(dǎo)茶樹揮發(fā)物的測(cè)定方法進(jìn)一步優(yōu)化。

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The Release of Volatiles in Resistant and Susceptible Tea Cultivars underFeeding

REN Qianqian1, ZHUANG Mingzhu1, CAI Xiaoming2, BIAN Lei2, LUO Zongxiu2,LI Zhaoqun2, YOU Minsheng3, CHEN Zongmao2*, JIN Shan1*

1. College of Horticulture, Key Laboratory of Tea Science, Fujian Agricultural and Forest university, Fuzhou 350002, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3. Institute of Applied Ecology, Agricultural and Forest university, Fuzhou 350002, China

In order to study the volatile release and the relative metabolism induced by small green leafhoppers () feeding in tea plants, the resistant tea cultivar (JY) and susceptible tea cultivar (EB) were used as materials. The time course (6, 12, 24, 36, 48, 72?h) of tea volatile compounds released by tea plants underfeeding were collected and detected by using dynamic headspace collection method and GC-MS technology. An integrative analysis of the metabolism and transcriptome data was then performed, and the target genes in the synthetic pathway of the main volatiles were screened and analyzed. The results show that healthy tea plants released less volatiles. While ten main volatiles such as-Ocimene, DMNT, Linalool, Farnesene, etc. were identified in tea plants underfeeding. Among them, the contents of monoterpenoids were higher in the susceptible tea cultivar EB, and sesquiterpenoids were higher in the resistant tea cultivar JY. Furthermore, transcriptome data show that the key genes in terpene synthesis pathway were up-regulated in both cultivars afterfeeding. The expression levels of genes related to the synthesis of monoterpenoids were relatively higher in susceptible tea cultivar than those in resistant cultivar. However, no significant expression differences were identified in genes related to sesquiterpenes synthesis in resistant and susceptible tea cultivars. The results of this study provided a theoretical basis for the tea resistance mechanism and green control of leafhopper in tea plantation.

tea plant, volatiles,, terpenoids, gene regulation

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2020)06-795-12

2020-06-22

2020-08-26

閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（SKL20190010）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFE0102100）、國(guó)家茶葉質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心開放課題（KIG17004A）

任倩倩，女，碩士研究生，主要從事茶葉質(zhì)量安全研究。*通信作者：zmchen2006@163.com；jinshan0313@163.com