徐亞晨 謝毅強(qiáng) 肖曼

[摘要] 目的 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)與平臺(tái)，挖掘半枝蓮治療胰腺癌的作用機(jī)制。 方法 基于TCMSP、NPASS、HIT、TCMID、TCM-ID及中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、維普網(wǎng)、科學(xué)引文索引（SCI）、PubMed等數(shù)據(jù)庫，檢索半枝蓮活性成分，檢索時(shí)限為1971年6月—2019年10月。利用預(yù)測(cè)平臺(tái)獲取并篩選各組分靶基因，維恩分析篩選成分靶基因與胰腺癌特異性基因交互基因，通過成分-靶點(diǎn)-疾病交聯(lián)確定重要成分及核心靶點(diǎn)，利用基因本體注釋（GO）分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路富集分析半枝蓮治療胰腺癌的分子機(jī)制。 結(jié)果 獲得半枝蓮類藥成分24種，提取交互基因73個(gè)，篩選出黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷、槲皮素、豆甾醇5種重要成分及AKT1、HSP90A1、腫瘤壞死因子、ESR1、表皮生長(zhǎng)因子受體、轉(zhuǎn)錄后基因沉默2、SRC、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶2、AR在內(nèi)的10個(gè)核心靶點(diǎn)。GO功能富集于細(xì)胞凋亡、炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，參與蛋白質(zhì)、ATP酶、DNA鏈特異性結(jié)合等。KEGG富集于癌癥、胰腺癌、癌癥蛋白多糖、Ras、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B途徑信號(hào)通路等。 結(jié)論 半枝蓮可能通過多類靶點(diǎn)，調(diào)控多條信號(hào)通路，影響多重細(xì)胞的功能，從而起到治療胰腺癌的作用，這也為臨床發(fā)掘治療胰腺癌的替代藥物提供了理論支撐。

[關(guān)鍵詞] 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);半枝蓮;胰腺癌;靶基因;富集

[中圖分類號(hào)] R285? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）10（b）-0123-06

[Abstract] Objective To study the mechanism of action of Scutellariae Barbatae Herba in treating pancreatic cancer by using network pharmacology. Methods Based on TCMSP， NPASS， HIT， TCMID， TCM-ID， CNKI， WANFANG DATA， CQVIP， Science Citation Index （SCI）， PubMed databases. The active constituents of Scutellariae Barbatae Herba were searched from June 1971 to October 2019. The prediction platform was used to acquire and screen target genes. Venn analysis was used to screen interaction genes between component target genes and pancreatic cancer specific genes， then determined the key targets of the drug through drug-target-disease cross-linking. Then fully utilized gene ontology （GO） analysis and kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） signal pathway enrichment to analyze molecular mechanism of Scutellariae Barbatae Herba in treating the disease. Results A total of 24 kinds of drug-like compounds were obtained， 73 target genes were determined， five core components including baicalein， wogonin， baicalin， quercetin， stigmasterol， and ten key targets such as AKT1， HSP90A1， tumor necrosis factor， ESR1， epidermal growth factor receptor， post-transcriptional gene silencing 2， SRC， matrix metalloproteinase 9， matrix metalloproteinase 2 and AR were screened out. GO enriched in the regulation of apoptosis， inflammation and oxidative stress， and were involved in the specific binding of proteins， ATPases and DNA. KEGG enriched in cancer， pancreatic cancer， cancer proteoglycan， Ras， phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B pathway. Conclusion Scutellariae Barbatae Herba may regulate multiple signaling pathways through multiple types of targets， affecting multiple function of cells， thus playing a role in the treatment of pancreatic cancer.

[Key words] Network pharmacology; Scutellariae Barbatae Herba; Pancreatic cancer; Target gene; Enrichment

胰腺癌是一種難治的惡性腫瘤，患者免疫能力低下，手術(shù)切除率低，5年生存率僅為5%，中位生存期為5～8個(gè)月，預(yù)后極差，被稱為“癌中之王”[1-2]，且多數(shù)患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，探討包括中藥治療在內(nèi)的活性藥物的早期治療十分重要。半枝蓮（barbated skullcup herb），別名水黃芩等，是馬唇形科黃芩屬植物。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中用于治療各種炎癥、血尿、早期癌癥等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，半枝蓮具有廣泛的抗癌、抗炎和抗菌生物活性[3-4]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)知識(shí)，利用生物信息學(xué)與藥理學(xué)的交叉結(jié)合，預(yù)測(cè)半枝蓮治療胰腺癌的活性成分與分子機(jī)制，以探究其內(nèi)在機(jī)制，也為藥物研發(fā)提供指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 半枝蓮有效化合物挖掘與篩選

查詢TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、NPASS（http：//bidd2.nus.edu.sg/NPASS）、HIT（http：//lifecenter.biosino.org/hit/）、TCMID（http：//www.mega bio net.org/tcmid/search/）、TCM-ID（http：//bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx）中草藥數(shù)據(jù)庫及中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、維普網(wǎng)、科學(xué)引文索引（SCI）、PubMed等文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)庫檢索半枝蓮化合物成分，檢索關(guān)鍵詞為“半枝蓮”“趕山鞭”“瘦黃芩”“水黃芩”“barbated skullcup herb”等。檢索時(shí)限為1971年6月—2019年10月。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選符合類藥屬性的化合物，包括口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.15。

1.2 半枝蓮有效化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

登陸TargetNet（http：//targetnet.scbdd.com）、Swiss target prediction（http：//swisstarget prediction.ch/）、STITCH（http：//stitch.embl.de/）在線平臺(tái)，利用化合物或化學(xué)相似性，預(yù)測(cè)半枝蓮經(jīng)篩選后的化合物靶蛋白，篩選提取其中結(jié)合分?jǐn)?shù)>0.5的蛋白質(zhì)即為該化合物的有效靶點(diǎn)，并構(gòu)建半枝蓮化合物-靶蛋白交互網(wǎng)絡(luò)。

1.3 半枝蓮“化合物-靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

登陸在線人類孟德爾遺傳（OMIM）（https：//omim.org/）、GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）等數(shù)據(jù)庫獲取與胰腺癌疾病進(jìn)展相關(guān)的基因。篩選提取結(jié)合分值高的特異性靶基因。預(yù)測(cè)靶蛋白與胰腺癌疾病高度關(guān)聯(lián)的靶基因進(jìn)行交叉分析，以此提取半枝蓮治療胰腺癌的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)，并運(yùn)用Cytoscape 3.6.1繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 半枝蓮治療胰腺癌蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）

維恩分析提取半枝蓮治療胰腺癌的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)中的核心靶蛋白。登陸Gene MANIA（http：//genemania.org/）、STRING（https：//string-db.org/）網(wǎng)站，錄入關(guān)鍵靶點(diǎn)，提取半枝蓮治療胰腺癌的PPI，并使用Cytoscape 3.6.1作圖。

1.5 半枝蓮治療胰腺癌基因本體注釋（Gene ontology，GO）分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

登陸David（Version 6.8 https：//david. ncifcrf.gov/），GO富集結(jié)果勾選細(xì)胞組成（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF），信號(hào)通路富集選擇KEGG數(shù)據(jù)庫，篩選條件以P < 0.05確定顯著富集結(jié)果并提取。登陸OMIC share（https：//www.omicshare.com/）繪制高級(jí)氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 半枝蓮24種類藥性化合物信息

進(jìn)行半枝蓮有效化合物挖掘與篩選，共篩選出24種類藥化合物。見表1。

2.3 半枝蓮“化合物-靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)圖

篩選出重要化合物包括黃芩素（baicalein）、漢黃芩素（wogonin）、黃芩苷（baicalin）、槲皮素（quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）等。見圖2。

2.4 半枝蓮治療胰腺癌靶點(diǎn)蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)

共提取出73個(gè)節(jié)點(diǎn)，2980個(gè)相互關(guān)系，其中AKT1、HSP90A1、腫瘤壞死因子（TNF）、ESR1、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、轉(zhuǎn)錄后基因沉默2（PTGS2）、SRC、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、AR等基因處于核心位置。見圖3。

2.5 半枝蓮治療胰腺癌GO分析與KEGG分析

GO富集于細(xì)胞凋亡、炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，參與蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA鏈特異性結(jié)合、ATP酶結(jié)合等。見圖4a（封四）。KEGG富集排名靠前包括癌癥通路，胰腺癌疾病通路，Ras信號(hào)通路，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B途徑（PI3K-AKT）信號(hào)通路，癌癥蛋白多糖通路等。見圖4b（封四）。胰腺癌疾病信號(hào)通路顯示基因顯著富集于PI3K/AKT/NF-κB、EGFR/PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路。見圖5。

3 討論

目前臨床上治療胰腺癌的方法包括手術(shù)切除、單藥及聯(lián)合藥物化療、放射、分子靶向治療等[5]，但絕大部分患者仍逃不過腫瘤惡化、轉(zhuǎn)移的命運(yùn)，從根本上控制胰腺癌的進(jìn)程仍十分棘手。半枝蓮具有成為抗胰腺癌藥物的潛在價(jià)值。本研究篩選了半枝蓮中5種主要化合物。研究表明[6-8]，黃芩素因其具有抗氧化、抗腫瘤的活性而受到廣泛關(guān)注，其已被證實(shí)可抑制包括卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)與增殖。目前的研究進(jìn)展顯示漢黃芩素具有抑制多種腫瘤增殖的藥理活性，包括血液系統(tǒng)腫瘤與消化系統(tǒng)腫瘤等[9-13]。進(jìn)一步研究顯示漢黃芩素能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡[14]。而槲皮素、豆甾醇均具有很好的廣泛抗腫瘤的效果。Mi等[15]利用毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定發(fā)現(xiàn)半枝蓮中漢黃芩素（0.033 mg/g）和黃芩素（0.027 mg/g）的含量分列第3、4位。這些基礎(chǔ)研究為半枝蓮抗腫瘤活性和本文虛擬預(yù)測(cè)結(jié)果提供了堅(jiān)實(shí)的文獻(xiàn)支持。

本文篩選出AKT1、HSP90A1、TNF、ESR1、EGFR、PTGS2、SRC、MMP9、MMP2、AR在內(nèi)的10個(gè)半枝蓮治療胰腺癌的核心基因，編碼治療疾病的核心蛋白。AKT1是AKT家族蛋白的一種，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)的功能。劉俊等[16]認(rèn)為其異常激活會(huì)促進(jìn)胰腺癌的生長(zhǎng)并拮抗癌細(xì)胞凋亡。ESR1屬細(xì)胞核受體超家族基因，其編碼的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核蛋白已成為早期乳腺癌靶向藥物治療的靶標(biāo)[17]。EGFR是表皮受體生長(zhǎng)因子，屬絡(luò)氨酸激酶跨膜受體，作為胰腺癌的分子治療重要靶標(biāo)，其研究正火熱開展[18]。而SRC激酶在EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，并與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)[19]。韓賀[20]利用數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PTGS2的表達(dá)與胰腺癌惡性進(jìn)展呈正相關(guān)，且對(duì)患者預(yù)后生存不利。MMP2和MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族蛋白，可促進(jìn)基膜及細(xì)胞外基質(zhì)的分解。綦俊[21]研究發(fā)現(xiàn)MMP2、MMP9均參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展，且在胰腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起著協(xié)同作用，有利于胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。李玉軍等[22]通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者呈現(xiàn)65.5%的AR陽性率，提示其為胰腺癌惡性進(jìn)展中的異常蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有的研究進(jìn)展也為虛擬預(yù)測(cè)的結(jié)果提供了理論支持。

GO注釋結(jié)果顯示藥物參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，參與蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA鏈特異性結(jié)合、ATP酶結(jié)合等，從多重角度產(chǎn)生功能效應(yīng)。KEGG主要富集的通路為癌癥通路、胰腺癌疾病通路、Ras信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、癌癥蛋白多糖通路等，結(jié)果顯示半枝蓮呈現(xiàn)出多組分多靶點(diǎn)達(dá)到治療胰腺癌的可能性。這些通路均與腫瘤發(fā)生過程及惡性進(jìn)展過程密切相關(guān)，半枝蓮?fù)ㄟ^作用于多條通路從而發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，這也與中醫(yī)藥通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮效應(yīng)的理念相契合。

總體而言，本文充分利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)知識(shí)與方法，對(duì)半枝蓮的多成分、多靶點(diǎn)、多通路與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中所涉及的廣泛、多元而復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)體系進(jìn)行交叉關(guān)聯(lián)分析。研究結(jié)果初步闡明了半枝蓮主要有效活性化合物及對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，并闡釋核心靶蛋白映射的相關(guān)功能與信號(hào)通路，為進(jìn)一步深入探討半枝蓮治療胰腺癌的分子機(jī)制提供了新的視角，后續(xù)需要進(jìn)行縝密科學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床藥物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確藥物的效果。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Liu Q，Liao Q，Zhao Y. Chemotherapy and tumor microenvironment of pancreatic cancer [J]. Cancer Cell Int，2017， 17（68）：64-68.

[2]? Kamisawa T，Wood LD，Itoi T，et al. Pancreatic cancer [J]. Lancet，2016，388（10039）：73-85.

[3]? Dai ZJ，Lu WF，Jie G，et al. Anti-angiogenic effect of the total flavonoids in Barbated skullcup herb [J]. BMC Complement Altern Med，2013，13（1）：150-159.

[4]? Wang TS. A review of phytochemistry and antitumor activity of a valuable medicinal species：Scutellaria barbata [J]. J Med Plants Res，2012，6（26）：4259-4275.

[5]? 韓連強(qiáng)，譚楊，楊奇，等.胰腺癌治療進(jìn)展[J].中華消化病與影像雜志：電子版，2019，9（2）：49-54.

[6]? Su MQ，Zhou YR，Rao X，et al. Baicalein induces the apoptosis of HCT116 human colon cancer cells via the upregulation of DEPP/Gadd45a and activation of MAPKs [J]. Int J Oncol，2018，53（2）：750-760.

[7]? Yu X，Cao Y，Tang L，et al. Baicalein inhibits breast cancer growth via activating a novel isoform of the long noncoding RNA PAX8-AS1-N [J]. J Cell Biochem，2018，119（8）：6842-6856.

[8]? Su G，Chen H，Sun X. Baicalein suppresses non-small cell lung cancer cell proliferation，invasion and Notch signaling pathway [J]. Cancer Bio，2018，22（1）：13-18.

[9]? Ikemoto S，Sugimura K，Yoshida N，et al. Antitumoreffects of Scutellariae radix and its components baicalein， baicalin， and wogonin on bladder cancer cell lines [J]. Urology，2000，55（6）：951-955.

[10]? Lee WR，Shen SC，Lin HY，et al. Wogonin and fisetin induce apoptosis in human promyeloleukemic cells，accompanied by a decrease of reactive oxygen species，and activation of caspase 3 and Ca（2+）-dependent endonuclease [J]. Bio Pharm，2002，63（2）：225-236.

[11]? Chang WH，Chen CH，Lu FJ. Different effects of baicalein，baicalin and wogonin on mitochondrial function，glutathione content and cell cycle progression in human hepatoma cell lines [J]. Planta Med，2002，68（2）：128-132.

[12]? Zhao Q，Wang J，Zou MJ，et al. Wogonin potentiates the antitumor effects of low dose 5-fluorouracil against gastric cancer through induction of apoptosis by down-regulation of NF-kappaB and regulation of its metabolism [J]. Toxicol Lett， 2010，197（3）：201-210.

[13]? Kim H，Kim YS，Kim SY，et al. The plant flavonoid wogonin suppresses death of activated C6 rat glial cells by inhibiting nitric oxide production [J]. Neurosci Lett，2001，309（1）：67-71.

[14]? 陳雙秀，劉剛，李先霞.漢黃芩素對(duì)胰腺癌作用的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[J].中國普通外科雜志，2013，22（9）：1152-1157.

[15]? Mi X，Zhu R. Simultaneous determination of 7 active ingredients in Scutellaria barabata D. Don by capillary micellar electrokinetic chromatography [J]. OALib J，2010， 28（2）：209-214.

[16]? 劉俊，江弢，黃陳，等.Akt在胰腺癌中的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2010，4（9）：1639-1642.

[17]? 趙爽，陳雙雙，于正洪.ESR1基因改變?cè)谌橄侔﹥?nèi)分泌治療耐藥中的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2016，21（10）：947-951.

[18]? 鐘志惟，殷香保.胰腺癌的分子靶向治療研究進(jìn)展[J].中國普通外科雜志，2016，25（9）：1351-1356.

[19]? Biscardi JS，Maa MC，Tice DA，et al. Src-mediated phos-phorylation of the epidermal growth factor receptor on Tyr845 and Tyr1101 is associated with modulation of receptor function [J]. J Biol Chem，1999，274（1）：8335-8343.

[20]? 韓賀.PGE2/AKT/p53軸調(diào)控化療后胰腺癌細(xì)胞干性轉(zhuǎn)化、增殖及其機(jī)制研究[D].江蘇：江蘇大學(xué)，2019.

[21]? 綦俊.MMP2、MMP9、VEGF在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2012.

[22]? 李玉軍，姜天福，許加剛.胰腺癌雄激素受體的臨床病理研究[J].中國腫瘤臨床，1997，5（4）：306-307.

（收稿日期：2020-02-21）