王瑋 崔婷

青海心腦血管病專科醫(yī)院呼吸科，西寧810000

COPD 是一種以不可逆氣流受限為主要特征的疾病，隨著病情的不斷發(fā)展，肺循環(huán)阻力增加，血管內(nèi)膜功能異常增生，血管纖維化與閉塞，肺循環(huán)結(jié)構(gòu)重塑，進(jìn)而誘發(fā)呼吸衰竭。流行病學(xué)調(diào)查顯示，COPD 患者的發(fā)病率以及病死率呈顯著上升趨勢(shì)[1]。目前認(rèn)為，COPD 患者的發(fā)病機(jī)制主要包括肺部的氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白酶和抗蛋白酶的失衡、慢性炎性反應(yīng)[2]。而在這其中，肺部的氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成患者COPD 進(jìn)展的重要原因。目前對(duì)于COPD 患者的治療主要是抗氧化治療。在對(duì)患者的治療效果的評(píng)價(jià)中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是氧化應(yīng)激信號(hào)從細(xì)胞表面到細(xì)胞核傳導(dǎo)的重要物質(zhì)[3]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular signalregulated kinase，ERK)信號(hào)通路被認(rèn)為是經(jīng)典MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。miR-20b 可通過(guò)抑制氣道內(nèi)上皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成等血管新生功能，造成氣道內(nèi)皮功能的障礙，進(jìn)而產(chǎn)生高氣道反應(yīng)[4]。本研究通過(guò)miR-20b 調(diào)節(jié)MAPK/ERK 途徑對(duì)COPD 動(dòng)物模型氣道炎癥改善情況及作用機(jī)制研究，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD 雌性小鼠120只，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證 號(hào)SCXK (京 ) 2019-0004， 批 號(hào)：25001700000268，體質(zhì)量16.5～25.3 g，年齡范圍為6～8周齡。所有小鼠均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南進(jìn)行飼養(yǎng)和處理，于恒溫環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)經(jīng)青海心腦血管病?？漆t(yī)院倫理委員會(huì)核實(shí)批準(zhǔn) (20190613)。使用隨機(jī)數(shù)字表，將以上小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、miR-20b組以及對(duì)照組，4組小鼠的體質(zhì)量、性別、飼養(yǎng)環(huán)境之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＞0.05)。

1.2 分組與給藥 模型組：采用香煙煙熏聯(lián)合脂多糖進(jìn)行COPD 模型制備。香煙為湖南中煙工業(yè)提供的相思鳥(niǎo)香煙。該種香煙的焦油量為11 mg，一氧化碳含量為13 mg，煙堿含量為0.9 mg。在實(shí)驗(yàn)小鼠氣道內(nèi)滴入脂多糖，同時(shí)進(jìn)行煙熏30 min，共持續(xù)4周，進(jìn)行COPD 模型制備。小鼠出現(xiàn)煙熏時(shí)喜扎堆，倦怠蜷縮，汗出，腹部脹大，呼吸急促，點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)，甚者張口呼吸明顯則為建模成功。miR-20b組：小鼠在建模成功后，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的鼻腔進(jìn)行miR-20b模擬物滴注40μl，每3天滴注1次，共滴注30 d。對(duì)照組：小鼠在建模成功后，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的鼻腔進(jìn)行生理鹽水滴注40μl，每3天滴注1次，共滴注30 d。空白組：正常小鼠，不采取任何措施。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 4組小鼠的肺功能比較 使用動(dòng)物肺功能儀對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的肺功能進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)中，將小鼠麻醉后完全固定，切開(kāi)頸下皮膚，充分暴露小鼠的氣管，行氣管插管術(shù)，連接動(dòng)物肺功能儀器，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、最大呼氣流量 (peak expiratory flow，PEF)、0.1 s呼氣量(0.1 s peak expiratory volum，PEV0.1)進(jìn)行比較。

1.3.2 4組小鼠的MDA 以及SOD 水平比較 分別對(duì)4組小鼠摘取眼球取血，使用離心機(jī)3 500 r/min離心15 min，離心半徑8.5 cm，取上清液采用硫代巴比妥以及水溶性四唑鹽進(jìn)行丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平的分析。

1.3.3 4組小鼠的炎性因子水平的比較 分別對(duì)4組小鼠的血清采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平進(jìn)行比較。

1.3.4 4組小鼠的ERK 蛋白以及磷酸化蛋白水平比較 分別對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的氣管進(jìn)行解剖、研磨后進(jìn)行ABC免疫組織化學(xué)染色，將待檢測(cè)的視網(wǎng)膜組織100 g 加入細(xì)胞裂解液1 ml和苯甲基磺酰氟10μl，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定相應(yīng)的蛋白水平后，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，采用脫脂牛奶封閉120 min后，添加一抗以及β-actin，4 ℃恒溫箱中過(guò)夜，再次添加辣根過(guò)氧化物標(biāo)記物標(biāo)記的各蛋白指標(biāo)以及二抗后，室溫下孵育60 min，使用image-lab軟件進(jìn)行條帶分析，計(jì)算β-actin 比值。采用蛋白印跡法對(duì)2組眼睛視網(wǎng)膜的MAPK 通路中的ERK 蛋白表達(dá)水平以及磷酸化蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件分析。其中計(jì)量資料采用±s，多組比較采用F 檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠的肺功能比較 4組小鼠的肺功能比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 值均＜0.05)，其中空白組FVC、PEF、PEV0.1高于miR-20b 組、模型組和對(duì)照組，miR-20b 組FVC、PEF、PEV0.1高于模型組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值均＜0.05)；而模型組和對(duì)照組的FVC、PEF、PEV0.1比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 值均＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 4組小鼠的肺功能比較 (±s)

表1 4組小鼠的肺功能比較 (±s)

注：FVC為用力肺活量；PEF 為最大呼氣流量；FEV 0.1為0.1 s呼氣量；與模型組比較，a P ＜0.05；與miR-20b組比較，b P ＜0.05；與對(duì)照組比較，c P ＜0.05

組別鼠數(shù)FVC (L)PEF (L)PEV0.1 (L)模型組20 2.15±1.05 18.10±6.33 0.42±0.01 miR-20b組20 5.18±1.64a 25.36±4.56a 1.55±0.32a對(duì)照組20 2.44±0.13b 18.22±5.11b 0.69±0.06b空白組20 7.36±2.13abc 32.29±5.09abc 4.72±1.09abc F 值6.990 7.089 12.300 P 值＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 4組小鼠的MDA 以及SOD 水平比較 4組小鼠的MDA 以及SOD 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 值均＜0.05)，其中模型組和對(duì)照組MDA 以及SOD 水平高于miR-20b 組、空白組，miR-20b組MDA 以及SOD 水平高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＜0.05)；而模型組和對(duì)照組的MDA 以及SOD 水平之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 4組小鼠的MDA 以及SOD 水平比較 (±s)

表2 4組小鼠的MDA 以及SOD 水平比較 (±s)

注：MDA 為丙二醛；SOD 為超氧化物歧化酶；與模型組比較，a P ＜0.05；與miR-20b 組比較，b P ＜0.05；與對(duì)照組比較，c P ＜0.05

組別鼠數(shù)MDA (nmol/L) SOD (×103 U/L)模型組20 7.93±2.74 26.33±1.05 miR-20b組20 4.56±2.62a 23.06±1.69a對(duì)照組20 7.27±2.75b 26.03±1.19b空白組20 3.96±1.05abc 18.41±1.03abc F 值12.365 10.257 P 值＜0.001＜0.001

2.3 4組小鼠的炎性因子水平比較 4組小鼠的IL-6、IL-8、TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＜0.05)，其中模型組和對(duì)照組IL-6、IL-8、TNF-α 水平高于 miR-20b 組、空白組，miR-20b組IL-6、IL-8、TNF-α水平高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 值均＜0.05)；而模型組和對(duì)照組的IL-6、IL-8、TNF-α水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 4組小鼠的炎性因子水平比較 (±s)

表3 4組小鼠的炎性因子水平比較 (±s)

注：TNF-α為腫瘤壞死因子；與模型組比較，a P ＜0.05；與miR-20b組比較，b P ＜0.05；與對(duì)照組比較，c P ＜0.05

組別鼠數(shù)IL-6 (ng/L)IL-8 (ng/L)TNF-α(ng/L)模型組20 90.38±10.31 684.49±51.01 248.45±50.11 miR-20b組20 78.32±11.22a 506.54±50.15a 199.92±50.13a對(duì)照組20 90.34±11.41b 683.18±50.12b 250.99±44.14b空白組20 56.85±11.56abc 382.44±50.14abc 140.35±40.09abc F 值20.120 12.254 14.552 P 值＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 4組小鼠的ERK 蛋白以及磷酸化蛋白水平比較 4組小鼠的ERK 蛋白以及磷酸化蛋白比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 值均＜0.05)，其中空白組ERK 蛋白水平高于miR-20b組、模型組和對(duì)照組，miR-20b組ERK 蛋白水平高于模型組和對(duì)照組，空白組磷酸化蛋白水平低于miR-20b 組、模型組和對(duì)照組，miR-20b組磷酸化蛋白水平低于模型組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 值均＜0.05)；而模型組和對(duì)照組的ERK 蛋白以及磷酸化蛋白水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 值均＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 4組小鼠的ERK 蛋白以及磷酸化蛋白水平比較 (±s)

表4 4組小鼠的ERK 蛋白以及磷酸化蛋白水平比較 (±s)

注：ERK 為細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；與模型組比較，a P ＜0.05；與miR-20b組比較，b P ＜0.05；與對(duì)照組比較，c P ＜0.05

組別鼠數(shù)ERK磷酸化蛋白模型組20 0.77±0.12 0.88±0.21 miR-20b組20 1.09±0.05a 0.65±0.12a對(duì)照組20 0.78±0.13b 0.87±0.19b空白組20 1.51±0.45abc 0.44±0.11abc F 值12.036 10.203 P 值＜0.001＜0.001

3 討論

COPD 是臨床常見(jiàn)的呼吸道疾病之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示[5]，約有3億人患有COPD，每年由于COPD 死亡的患者多達(dá)250 000例以上，同時(shí)患者的發(fā)病率以及病死率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。COPD 發(fā)病原因?yàn)槊庖吖δ芙档图癟 細(xì)胞亞群平衡紊亂，導(dǎo)致炎癥通路激活，導(dǎo)致機(jī)體一直在過(guò)氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]，所以通過(guò)對(duì)患者的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行及時(shí)有效的分析，及時(shí)有效對(duì)患者的治療進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)于患者的預(yù)后具有顯著的優(yōu)勢(shì)[7]。MAPK/ERK 信號(hào)通路作為重要的細(xì)胞外傳遞介質(zhì)，對(duì)于氣道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及凋亡具有積極的意義。ERK 蛋白作為重要的應(yīng)激激活蛋白以及氨基末端激酶，顯著調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子以及營(yíng)養(yǎng)性因子的釋放，進(jìn)而調(diào)控其炎性因子的分泌[8]。

本研究中，4 組小鼠的肺功能比較，空白組FVC、PEF、PEV0.1高于miR-20b 組、模型組和對(duì)照組，miR-20b 組FVC、PEF、PEV0.1高于模型組和對(duì)照組；提示實(shí)驗(yàn)小鼠的煙熏以及脂多糖的模擬效果顯著，實(shí)驗(yàn)組小鼠的肺功能顯著下降，同時(shí)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)M小鼠的miR-20b 治療，氣道高反應(yīng)性顯著降低，小鼠的肺功能恢復(fù)顯著[9]。模型組以及對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示排除對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼻腔滴注液體的發(fā)病可能。而通過(guò)對(duì)4組實(shí)驗(yàn)小鼠的炎性因子水平的分析，4組小鼠的MDA、SOD、IL-6、IL-8、TNF-α 水平比較，模型組和對(duì)照組MDA 以及SOD 水平高于miR-20b組、空白組，miR-20b組MDA 以及SOD 水平高于空白組；模型組和對(duì)照組IL-6、IL-8、TNF-α水平高于miR-20b組、空白組，miR-20b組IL-6、IL-8、TNF-α水平高于空白組；進(jìn)一步驗(yàn)證了隨著實(shí)驗(yàn)小鼠的氣道刺激性作用增強(qiáng)，其上皮細(xì)胞的損傷性增強(qiáng)[10]，而在對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的miR-20b的治療中，實(shí)驗(yàn)小鼠的炎性介質(zhì)顯著下降，肺功能顯著提升。馬華等[11]對(duì)哮喘模擬小鼠的分析指出，通過(guò)對(duì)哮喘實(shí)驗(yàn)小鼠的miR-20b 治療，實(shí)驗(yàn)小鼠的炎性介質(zhì)水平顯著下降，臨床癥狀改善，與本研究結(jié)果相互印證。而在對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平的分析中，隨著實(shí)驗(yàn)小鼠的炎性物質(zhì)水平的降低，其氣道高反應(yīng)性得到進(jìn)一步緩解，局部黏膜的病灶新生血管能力下降，對(duì)于小鼠通氣功能的改善具有積極的意義。

在對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠ERK 蛋白以及磷酸化蛋白水平比較中，4組小鼠的ERK 蛋白以及磷酸化蛋白水平比較，其中空白組ERK 蛋白水平高于miR-20b組、模型組和對(duì)照組，miR-20b組ERK 蛋白水平高于模型組和對(duì)照組，空白組磷酸化蛋白水平低于miR-20b組、模型組和對(duì)照組，miR-20b組磷酸化蛋白水平低于模型組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＜0.05)，分析認(rèn)為，在機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)MAPK/ERK 信號(hào)途徑的有效抑制性作用，進(jìn)而對(duì)巨噬細(xì)胞源性脂蛋白酯酶表達(dá)的顯著性下調(diào)，降低機(jī)體的細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠的鼻腔進(jìn)行miR-20b模擬物滴注，其應(yīng)激反應(yīng)下降，局部高反應(yīng)性降低，從而改善COPD 小鼠的氣道炎癥情況。

綜上所述，miR-20b通過(guò)抑制性調(diào)節(jié)MAPK/ERK 途徑，顯著改善COPD 動(dòng)物模型氣道炎癥反應(yīng)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突