赫連遠坤，馬欣娟，張 婷，呂慧威，張 平，孫玉梅

（1.大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.吉林師范大學 博達學院，吉林 四平 136000；3.遼寧太陽谷莊園葡萄酒業(yè)股份有限公司，遼寧 遼陽 111000）

葡萄酒釀造使用的葡萄通常破碎后直接發(fā)酵，但在夏季高溫多雨的葡萄種植區(qū)，葡萄容易爆發(fā)霜霉病、白粉病、炭疽病等病害，為了不影響葡萄的正常收獲，果農(nóng)們會噴灑殺蟲劑、殺菌劑和除草劑等農(nóng)藥，導致葡萄皮上有一定的農(nóng)藥殘留[1]。研究發(fā)現(xiàn)，殘留的農(nóng)藥會影響葡萄酒釀造過程中酵母的生長代謝，延遲發(fā)酵，產(chǎn)生一些不良代謝產(chǎn)物和異味物質(zhì)，影響到葡萄酒的口感、香味等感官質(zhì)量[2-3]和食用的安全性[4-5]。另外，葡萄皮上殘留的有害微生物在葡萄發(fā)酵過程中與釀酒酵母菌群爭奪養(yǎng)分，影響發(fā)酵并且會產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物，比如醋酸菌可產(chǎn)生大量醋酸，引起葡萄酒的酸敗味，霉菌可使果酒產(chǎn)生霉味等[6-8]。減少葡萄皮上農(nóng)藥殘留和有害微生物，對葡萄酒正常發(fā)酵、質(zhì)量及飲用安全性將有一定積極作用。

通常葡萄釀酒不需要清洗原料，主要是利用葡萄表皮附著的微生物進行發(fā)酵。對于泥沙較多的葡萄原料在釀酒前需要對原料進行清洗瀝干處理[9]，但尚鮮見關于清洗葡萄的研究報道。本研究采用1%鹽水、1%淀粉液和自來水對赤霞珠葡萄進行清洗，以不清洗的葡萄原料為對照，通過不同的清洗方法造成葡萄不同的潔凈度，旨在研究不同潔凈度葡萄發(fā)酵的效果，并監(jiān)測不同清洗條件下發(fā)酵過程的菌群生長、還原糖消耗、可溶性固形物變化、乙醇含量、乙酸含量及香氣物質(zhì)含量變化等，考察不同潔凈度葡萄對葡萄酒發(fā)酵效果的影響，為釀酒葡萄原料的狀態(tài)控制提供理論依據(jù)，以保證正常良好的葡萄酒發(fā)酵過程和終產(chǎn)物葡萄酒質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

赤霞珠葡萄：河北昌黎盧龍華夏基地中糧集團華夏葡萄酒公司；ST活性干酵母：遼寧本溪桓仁五女山米蘭酒業(yè)有限公司。

1.1.2 化學試劑

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司；氯化鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸三鐵、硫酸亞鐵、硫酸錳、苯酚、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、葡萄糖（均為分析純）：天津市天河化學試劑廠；玉米淀粉：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；亞硫酸（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[10-13]

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，3.2×104U/L青霉素和4×104U/L的鏈霉素（用孔徑為0.22 μm的水系膜過濾除菌），調(diào)pH至6.0。

肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，納他霉素25%，調(diào)pH至7.2～7.4。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.05%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸亞鐵0.001%，氯化鉀0.05%，蔗糖3%，瓊脂2%，3.2萬單位/L青霉素與4萬單位/L的鏈霉素（用孔徑為0.22 μm的水系膜過濾除菌），調(diào)pH至6.7。

1.2 儀器與設備

UV-5200型分光光度計：上海元析儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；H1750R離心機：湘儀離心機儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器：金壇市金城翔龍儀器廠；DNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；DW-86L-386立式超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司；LERD-TECH高壓蒸汽滅菌器、Memmert低溫培養(yǎng)箱：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；Agilent7697A頂空進樣器、AgilentGC6850氣相色譜儀：美國安捷倫公司；KT-2000恒溫搖床：常州市中貝儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 活性干酵母的活化及培養(yǎng)

將1 g ST活性干酵母溶于10 mL無菌水，40 ℃恒溫水浴培養(yǎng)15 min，每5 min輕微搖動一次，培養(yǎng)完成后得到一級活化液；隨后將10 mL稀釋到20°Bx左右的模擬葡萄汁，加入到一級活化液中，25 ℃恒溫水浴培養(yǎng)1 h，每30 min輕微搖動一次，培養(yǎng)完成后得到20 mL二級活化液，取20 mL的40°Bx左右的模擬葡萄汁，加入到二級活化液中，20 ℃恒溫水浴培養(yǎng)2 h，每30 min輕微搖動一次。最后得到40 mL 0.25 g/L的酵母種子液。

1.3.2 葡萄原料的預處理

將1.8 kg成串的赤霞珠葡萄分成3等份，分別浸沒于4 L的1%鹽水、1%淀粉水及自來水中，在90 r/min搖床清洗10 min，撈出后，分別用4 L自來水在90 r/min的搖床清洗3次，每次清洗5 min，自然晾干后將果粒剪下，手帶一次性手套擠壓2層紗布包裹的葡萄果粒，將破碎處理后的葡萄皮和葡萄汁液裝入500 mL三角瓶內(nèi)，添加亞硫酸，使SO2含量為60 mg/L，每個處理3個平行。

1.3.3 葡萄酒的制備

將上述清洗處理的葡萄的葡萄漿，接種活化的酵母液，使接入的酵母量為102個/mL。接種后，混合均勻，瓶口安裝發(fā)酵栓，以排放發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，在15～18 ℃靜置發(fā)酵26 d，以還原糖不再降低視為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中定期取樣測定微生物菌群、理化指標及主要香氣物質(zhì)。

1.3.4 取樣及樣品預處理

發(fā)酵過程中每3天取樣一次，在取樣前將帶有發(fā)酵栓的玻璃錐形瓶以順時針搖勻。將用于測定還原糖、可溶性固形物和揮發(fā)性物質(zhì)的樣品離心（4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min）以除去菌群細胞，保存于-20 ℃冰箱中待測。

1.3.5 分析檢測

（1）菌群的測定[14]

采用稀釋涂平板法測定微生物菌群。將發(fā)酵液適當稀釋后，分別在YEPD培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基接種0.2 mL于30 ℃靜置培養(yǎng)至菌落不再增加為止，進行酵母菌、細菌和霉菌落計數(shù)。

（2）還原糖含量和可溶性固形物的測定[15-16]

用DNS法測定還原糖含量。用手持糖量折光儀直接測定可溶性固形物含量[17]。

（3）揮發(fā)性物質(zhì)含量測定[18-19]

乙醇、乙酸和香氣成分含量都采用氣相色譜測定。

樣品前處理：依次將1.4 g NaCl、磁力攪拌轉(zhuǎn)子和7 mL發(fā)酵上清液加入15 mL頂空氣相瓶中，用聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）墊密封，放置在磁力攪拌器上，在250 r/min下攪拌10 min。

頂空進樣條件：Agilent 7697A頂空進樣器；樣品平衡溫度90 ℃；樣品平衡時間30 min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃。

氣相色譜條件：Agilent DB-FFAP毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜柱初始溫度40 ℃，穩(wěn)定10 min，以5 ℃/min 升溫至180 ℃，穩(wěn)定1 min，然后以20 ℃/min升溫至230℃，穩(wěn)定2min；空氣流量300mL/min，氫氣流量30mL/min，載氣為氮氣（N2）流量10 mL/min，分流比10∶1，進樣量2 μL。

1.3.6 統(tǒng)計分析

所有實驗均進行3次平行，數(shù)值表示為3次獨立實驗的“平均值±標準偏差”。使用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行顯著性分析，然后以P＜0.05的水平確定Duncan。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同清洗方法的葡萄發(fā)酵過程中的菌群變化

由圖1A可知，經(jīng)不同方式清洗的葡萄初始酵母菌數(shù)量為對照組＞自來水＞1%淀粉液＞1%鹽水；發(fā)酵0～6 d各實驗組的酵母數(shù)量差別很小，8 d后鹽水處理組酵母菌數(shù)量最多，達到約1.26×1010個/mL，其次為淀粉液處理組，酵母菌數(shù)量達到3.47×109個/mL，自來水處理組和對照組酵母菌數(shù)量最少，酵母菌數(shù)量分別是1.10×109和1.26×108個/mL。由圖1B可知，初始細菌數(shù)以淀粉液和鹽水處理較少，細菌數(shù)分別為9.00×102和1.00×103個/mL，整個發(fā)酵過程中只有第8天的細菌數(shù)量高于對照組（可能是測量誤差引起的），其余時間均低于對照組。由圖1C可知，在發(fā)酵過程中，各實驗組的霉菌數(shù)均表現(xiàn)為發(fā)酵4 d達到最大值后降低，清洗組霉菌數(shù)量一直低于對照組，鹽水處理組的霉菌在第12天全部消失，淀粉液處理組比對照組和自來水處理組的霉菌數(shù)量下降快。

產(chǎn)生這些現(xiàn)象的原因主要是在發(fā)酵過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，酵母逐漸占據(jù)優(yōu)勢。鹽水處理組能夠清洗掉較多的細菌和霉菌，整個發(fā)酵過程中的細菌和霉菌數(shù)量比其他組少，與酵母的營養(yǎng)競爭弱，更有利于酵母的生長，發(fā)酵后期的酵母數(shù)量也就比其他實驗組多。淀粉液處理組的細菌和霉菌雖然前期略多，但后期較少，所以發(fā)酵后期的酵母菌數(shù)量也比較多，可能與清洗去除葡萄表皮的化學物質(zhì)（比如農(nóng)藥）有關。

綜上分析，用1%鹽水或1%淀粉液清洗葡萄有助于減少霉菌和細菌數(shù)量，提高葡萄潔凈度，提高發(fā)酵過程中酵母數(shù)量，從而有利于葡萄酒的釀造。

2.2 不同清洗方法的葡萄發(fā)酵過程中的還原糖及可溶性固形物含量變化

圖2 不同清洗方法的葡萄發(fā)酵過程中的還原糖及可溶性固形物含量變化Fig.2 Change of reducing sugar and soluble solid contents in the fermentation process of grape washed by different methods

由圖2A和圖2B可知，發(fā)酵過程中的還原糖和可溶性固形物的變化趨勢相同。各實驗組的還原糖和可溶性固形物均在發(fā)酵的前10 d快速下降，下降速度和幅度依次為鹽水處理組＞淀粉液處理組＞自來水處理組＞對照組；發(fā)酵12 d后各實驗組的還原糖和可溶性固形物含量基本穩(wěn)定并且很接近。經(jīng)鹽水處理的葡萄初始微生物數(shù)量較少，而發(fā)酵過程中酵母數(shù)量較多，因此其發(fā)酵效率較高，表現(xiàn)出還原糖和可溶性固形物的消耗較多較快。這與PRETORIUS I S等[20]用檸檬酸鹽清洗液清洗葡萄明顯減少有害微生物提高發(fā)酵效率的研究結(jié)果類似。

結(jié)果表明，用1%鹽水、1%淀粉液或自來水清洗的釀酒葡萄，僅在葡萄酒發(fā)酵過程中表現(xiàn)出還原糖和可溶性固形物消耗的差別，但發(fā)酵終點的含量很相近。用1%鹽水或1%淀粉液清洗葡萄能有效的去除果皮上的微生物，從而更有利于發(fā)酵過程中酵母菌的生長和代謝，促進還原糖和可溶性固形物的消耗，提高葡萄酒發(fā)酵效率。

2.3 不同清洗方法的葡萄發(fā)酵過程中的乙醇和乙酸含量變化

圖3 不同清洗方法的葡萄發(fā)酵過程中的乙醇（A）和乙酸（B）含量變化Fig.3 Change of ethanol (A) and acetic acid (B) contents in the fermentation process of grape washed by different methods

由圖3A可知，不同實驗組的葡萄在發(fā)酵過程中乙醇生成規(guī)律基本一致。在發(fā)酵的前2 d均未產(chǎn)生乙醇；隨后快速產(chǎn)生乙醇，對照組和自來水處理組在發(fā)酵6 d和12 d開始出現(xiàn)產(chǎn)乙醇減慢。20 d后原料逐漸消耗殆盡，乙醇含量開始趨向平穩(wěn)。在整個發(fā)酵過程中，清洗組的乙醇含量都要高于對照組，其中1%鹽水處理組的乙醇含量最高，對照組的乙醇含量最低。在發(fā)酵初期葡萄漿內(nèi)有較多溶解氧，酵母主要進行生長和繁殖。細胞生長繁殖消耗大量的溶解氧，隨后酵母菌在相對厭氧的環(huán)境下代謝產(chǎn)乙醇。由于清洗組比對照組的細菌和霉菌數(shù)量少，酵母在競爭中迅速占據(jù)優(yōu)勢，能夠更快更多產(chǎn)乙醇，其中，鹽水處理組最終的乙醇含量最高。

由圖3B可知，在葡萄酒發(fā)酵過程中，乙酸含量逐漸升高。在發(fā)酵前3 d，淀粉處理組迅速生成乙酸，在發(fā)酵3～5 d保持穩(wěn)定；在發(fā)酵后期，自來水處理組的乙酸含量最高，其次為對照組；在2～26 d發(fā)酵過程中，1%鹽水處理組的乙酸生成量一直比其他組低。

綜上分析，1%鹽水清洗葡萄可提高發(fā)酵過程中乙醇的生成速率和葡萄酒中的乙醇含量，1%淀粉液處理的效果次之。1%鹽水清洗能夠更好的清洗掉葡萄上的醋酸菌，減少發(fā)酵過程中醋酸的產(chǎn)生，1%淀粉液清洗的效果次之。

2.4 不同清洗方法的葡萄發(fā)酵過程中的香氣物質(zhì)含量變化

由圖4A～4D可知，高級醇的生成主要集中在發(fā)酵的前期和中期。在發(fā)酵過程中，異丁醇一直處于上升狀態(tài)，異戊醇、β-苯乙醇和2,3-丁二醇含量先升高后降低。在發(fā)酵過程中的大多數(shù)時段，自來水處理組的異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇的生成量最高，其次為1%鹽水處理組，處理組中1%淀粉液處理組的異丁醇生成量最低，對照組異戊醇和β-苯乙醇的生成量最低。葡萄在發(fā)酵過程中異戊醇含量均高于其他高級醇，分別占高級醇含量的67%～81%。對照組、自來水、1%鹽水及1%淀粉液處理組的葡萄所釀的葡萄酒中總高級醇含量依次為63.89 mg/L、105.37 mg/L、98.73 mg/L和142.79 mg/L。當葡萄酒中高級醇的總量≤300 mg/L時，高級醇的含量越高，葡萄酒的風味就越復雜。對比四組高級醇總量，發(fā)現(xiàn)對葡萄進行清洗能夠提高葡萄酒的風味復雜性。其中淀粉液處理的效果最好，其次是自來水和鹽水。

由圖4E和圖4F可知，清洗過的葡萄釀造的葡萄酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯的產(chǎn)量明顯比對照組低，自來水處理組是所有清洗組中酯類化合物生成量較多的，這可能與清洗過的葡萄上細菌數(shù)量少，產(chǎn)生的乙酸或乙醇的產(chǎn)量少有關。與高級醇相比，酯類物質(zhì)的形成過程更為復雜，酯類物質(zhì)的合成可能受有機酸和高級醇的影響，有機酸經(jīng)酯化反應生成相應的酯，乙酸乙酯就是其中的一種，因其獨特的甜味和果香味，被作為葡萄酒中重要的風味物質(zhì)，但葡萄酒中乙酸乙酯含量也不宜過高，濃度過高時容易產(chǎn)生刺激性氣味。葡萄酒釀造過程中乙酸乙酯含量與乙酸含量正相關。鹽水處理組乙酸產(chǎn)生量最低，所以乙酸乙酯的生成量也最低，葡萄酒中的總酯含量也就最低。

綜上分析，清洗葡萄能夠提高葡萄酒的異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇以及總高級醇含量，但會降低2,3-丁二醇含量和酯類化合物總含量。1%淀粉清洗有助于提高葡萄酒中高級醇的含量，最有利于提高葡萄酒的風味復雜性。

圖4 不同清洗方法的葡萄發(fā)酵過程中的香氣物質(zhì)含量變化Fig.4 Change of aroma compounds contents in the fermentation process of grape washed by different methods

3 結(jié)論

采用1%鹽水、1%淀粉液和自來水清洗赤霞珠葡萄，發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同清洗方式處理的葡萄在發(fā)酵過程中酵母菌、細菌和霉菌數(shù)量、還原糖消耗量、可溶性物質(zhì)含量以及乙醇、乙酸和典型香氣物質(zhì)的含量差異顯著（P＜0.05）。清洗或者提高葡萄清潔度都有助于提高發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量、糖和可溶性固形物消耗速率、乙醇生成速率和產(chǎn)量以及高級醇產(chǎn)量，減少霉菌和細菌數(shù)量、乙酸生成速率和產(chǎn)量，1%鹽水和1%淀粉液清洗的葡萄發(fā)酵效果更突出。足以見得，葡萄的清潔度對葡萄酒發(fā)酵過程和最終的葡萄酒質(zhì)量均有影響。因此，很好地控制葡萄的清潔度是提高葡萄酒質(zhì)量的重要保證。