尹紫良，王長麗，葛菁萍

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080；

2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其具有易于培養(yǎng)、安全可靠、代謝產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)價值和使用附加值高等優(yōu)點，長期以來一直是生物工業(yè)發(fā)展的主力軍[1-2]。它在工業(yè)上的能源開發(fā)、醫(yī)藥研究、食品生產(chǎn)以及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域為人類做出了許多突出的貢獻(xiàn)[3-5]。通常情況下，S.cerevisiae單倍體菌株是二倍體菌株在缺乏碳源和氮源的環(huán)境中，通過減數(shù)分裂形成的[6]。

S.cerevisiae單倍體與二倍體菌株相比，具有以下4個方面的優(yōu)勢：一是它們的基因組簡單并且穩(wěn)定，利于學(xué)科研究及工業(yè)化生產(chǎn)運(yùn)用[7]；二是它們的比表面積大，代謝效率更高；三是它們普遍具有明顯的代謝特征，多被用于一些特殊產(chǎn)物的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)[8-9]；四是它們的環(huán)境耐受能力極強(qiáng)，在一些營養(yǎng)不良或一些極端的環(huán)境中較二倍體菌株享有優(yōu)勢[10-11]。所以近年來，單倍體菌株的制備及代謝潛能開發(fā)，成為了工業(yè)生產(chǎn)上的一個熱門研究領(lǐng)域[12-13]。與此同時，根據(jù)S.cerevisiae自身交配型位點MAT基因座攜帶信息的不同，單倍體菌株又被分為MAT-a和MAT-α兩種不同的細(xì)胞配型[14]。作為S.cerevisiae一種原始的性別分化現(xiàn)象，兩種不同細(xì)胞配型也經(jīng)常被用作細(xì)胞譜系、基因沉默和基因組重排分析研究的重要模型[15]。由于在減數(shù)分裂過程中非同源染色體會重新組合，同源染色體間會發(fā)生部分交換，所以也就導(dǎo)致同一母細(xì)胞分裂出的單倍體個體間出現(xiàn)基因型及表型的差異[16-17]。目前對于單倍體釀酒酵母菌株的制備主要分為兩種，一種是通過基因工程手段對二倍體S.cerevisiae進(jìn)行HO基因（調(diào)控交配型位點MAT基因座的信息表達(dá)）的修飾，從而間接獲得單倍體菌株[18-19]，另一種是對二倍體S.cerevisiae的產(chǎn)孢條件進(jìn)行優(yōu)化，通過誘導(dǎo)二倍體菌株進(jìn)行減數(shù)分裂產(chǎn)孢，從而制備單倍體菌株。與第一種方法制備的單倍體菌株不同的是，第二種方法獲得的單倍體菌株能夠與S.cerevisiae標(biāo)準(zhǔn)單倍體菌株W303（MAT-α）一樣，進(jìn)入一種保護(hù)性的并且不分裂的靜止?fàn)顟B(tài)[20]，使其能夠在非逆境狀態(tài)下以單倍體的形式穩(wěn)定的進(jìn)行繁殖，并且由于它們的HO基因未被修飾，所以也有利于其代謝潛能的開發(fā)及利用。

本研究通過隨機(jī)孢子分離[21]、MAT-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[22]、倍型雜交實驗[23]和連續(xù)傳代培養(yǎng)[24]等方法對二倍體S.cerevisiaeW5（MATa/α）進(jìn)行單倍體菌株的分離鑒定和制備。并通過實驗分析其代謝水平上的產(chǎn)物變化及代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶的酶活力特性。最終獲得一株遺傳穩(wěn)定性高且代謝特征明顯的單倍體S.cerevisiaeZ5（MAT-α），為實驗室S.cerevisiaeW5菌株的單倍體制備提供了研究經(jīng)驗，并且也對該菌株的代謝潛能開發(fā)提供了新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W5（MATa/α）：由黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室保藏，用于單倍體菌株的分離制備；S.cerevisiaeW303-1A（MAT-α）：由暨南大學(xué)劉寰宇教授和江南大學(xué)張梁教授饋贈，用于單倍體菌株的鑒定[23]；S.cerevisiaeZ5（MAT-α）：由實驗自行篩選，并由黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（均為生化試劑）、（NH4）2SO4、K2HPO4、ZnSO4·7H2O（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；蝸牛酶（3 000 U）：上海藍(lán)季科技有限公司；Tris-HCl、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）、TritonX-100、二硫蘇糖醇：上海北諾生物科技有限公司；孔雀石綠、番紅O、生物素（biotin）、肌醇（inositol）、琥珀酸（succinic acid）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）polymerase和脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixture：日 本TaKaRa公司；丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、α-乙酰乳酸脫羧酶（α-acetolactate synthase，ILV2）、2,3-丁二醇脫氫酶（2,3-butanediol dehydrogenase，BDH1）的酶活力試劑盒和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白法含量測試盒：蘇州（科銘）生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）瓊脂培養(yǎng)基[18]：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，蒸餾水定容至1 L，用于S.cerevisiaeW5的培養(yǎng)。

改良YPD培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母提取物8 g/L，ZnSO4·7H2O 25 mg/L，瓊脂粉20 g/L，蒸餾水定容至1 L，用于產(chǎn)孢前S.cerevisiaeW5的培養(yǎng)。

改良SPM產(chǎn)孢培養(yǎng)基[25]：酵母粉2.5 g/L，KAc 10 g/L，KH2PO41 g/L，瓊脂粉20 g/L，琥珀酸23.6 g/L，生物素2 μg/L，ZnSO4·7H2O 0.125 g/L，肌醇100 μg/L，蒸餾水定容至1 L，pH 6.0，用于S.cerevisiaeW5的產(chǎn)孢。

葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，蛋白胨20 g/L，無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acid，YNB）3.4 g/L，KH2PO411.8 g/L，K2HPO43 g/L，（NH4）2SO410 g/L，蒸餾水定容至1 L，pH 5.0，用于S.cerevisiaeW5和Z5的葡萄糖搖瓶發(fā)酵。

以上培養(yǎng)基均采用108 ℃高溫濕熱滅菌20 min，除產(chǎn)孢培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基的pH值均自然。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）：島津國際貿(mào)易上海有限公司；BX43型OLYMPUS的正置熒光顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BACKMAN臺式離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SANYO蒸汽壓力滅菌鍋：日本三洋電子有限公司；Alphal mager型凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple 公司；SW-CJ型生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單倍體菌株的制備

實驗室前期已經(jīng)摸索出了一套行之有效的單倍體菌株的制備方法[26]，但為滿足本次實驗的需要，在先前實驗方法的基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步的優(yōu)化：將產(chǎn)孢培養(yǎng)周期優(yōu)化為8 d，以7 000 r/min對處理后的孢子菌懸液進(jìn)行離心處理，在破壁結(jié)束后改用12 000 r/min離心1 min收集菌體，加入500 μL 0.5% TritonX-100和5 μL 30%二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）重懸菌液，60 ℃水浴10 min。單倍體菌株鑒定和命名主要利用MAT-PCR法[23]，PCR擴(kuò)增體系：2.5 μL Mg2+10×TaqBuffer，2μL2.5mmol/LdNTP，1.0μL的各引物（表1），1.0 μL模板DNA，16 μL雙蒸水（ddH2O），0.5 μL 2.5 U/μLTaqDNA polymerase。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；然后94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。鑒定完畢的單倍體菌株通過連續(xù)傳代培養(yǎng)5代的方式進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析，最終通過與標(biāo)準(zhǔn)單倍體菌株W303-1A（MAT-α）以1∶1的比例在YPD培養(yǎng)基上進(jìn)行雜交實驗，并通過菌株的形態(tài)學(xué)觀察再次驗證其配型是否發(fā)生改變[24]。

表1 驗證單倍體的引物Table 1 PCR primers used to identify haploid

1.3.2 單倍體菌株的代謝水平分析

將S.cerevisiaeZ5與W5分別接種到液體YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以10%（V/V）接種量分別轉(zhuǎn)接至葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h，每12 h取3 mL菌液測OD600nm值和pH值。另外取樣1 mL菌液稀釋100倍后12 000 r/min離心10 min，使用HPX-87H色譜柱，以0.005 mol/L硫酸為流動相，在示差檢測器溫度為40 ℃，色譜柱溫65 ℃條件下，控制流速為0.8 mL/min，檢出時間為20 min，利用高效液相色譜（HPLC）檢測葡萄糖、乙醇、甘油、乙酸和乙偶姻的質(zhì)量濃度，并通過各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出二者代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)，最后對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析。

1.3.3 單倍體菌株的關(guān)鍵酶活性檢測

由于樣品的可溶性蛋白含量常用于關(guān)鍵酶活性測定，實驗首先采用二喹啉甲酸（BCA）法[27]，每隔12 h取樣進(jìn)行兩菌株胞內(nèi)胞外的總蛋白含量（extracellular extracellular protein content，Cpr）的測定，具體方法參照BCA法蛋白含量測試盒說明書。其次再利用丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶、α-乙酰乳酸脫羧酶和2,3-丁二醇脫氫酶測試盒，參照說明書分別測定兩菌株代謝過程中PDC、ADH、ILV2和BDH1四個關(guān)鍵酶活力的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 單倍體菌株制備

S.cerevisiaeW5（MATa/α）在改良SPM產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d后，此時有大量的孢子產(chǎn)生（圖1A）。用30 mg/mL蝸牛酶液對產(chǎn)生孢子的菌體破壁處理2 h，稀釋涂布在YPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d即可得到大量的單菌落（圖1B）。隨后利用隨機(jī)孢子分析法挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并運(yùn)用MAT-PCR（圖1C），對實驗獲得的單倍體菌株進(jìn)行PCR驗證（404 bp處有條帶的為MAT-α型，544 bp處有條帶的為MAT-a型），最終通過連續(xù)5代的傳代培養(yǎng)后，得到一株代謝及遺傳穩(wěn)定性較高的MAT-α型單倍體菌株，將其命名為S.cerevisiaeZ5（MAT-α）。由于該菌株與標(biāo)準(zhǔn)單倍體菌株W303-1A（MAT-α）屬于同一種細(xì)胞配型的單倍體菌株，所以二者不會產(chǎn)生交配形成異宗配合的二倍體細(xì)胞（圖1D），隨后將該菌株與二倍體S.cerevisiaeW5（MATa/α）進(jìn)行顯微鏡下的形態(tài)觀察（圖1E1-2/F1-2）：S.cerevisiaeZ5（MAT-α）細(xì)胞呈圓球形、細(xì)胞小（3～6 μm）、菌落直徑為0.2～0.3 cm、易聚集成團(tuán)、沿著軸向方式出芽、母細(xì)胞與出芽緊密相連；而二倍體S.cerevisiaeW5（MATa/α）細(xì)胞呈橢圓形、較大（5～10 μm）、菌落直徑為0.4～0.6 cm、分散生長快、沿極向方式連續(xù)出芽、且出芽在母細(xì)胞的任意一端；但二者菌落都為乳白色、呈隆起狀、濕潤、邊緣光滑。該觀測結(jié)果與KASSIR Y等[17]觀察到的二倍體S.cerevisiae比單倍體菌株個體更大，更呈橢圓形這一實驗結(jié)果一致。

圖1 釀酒酵母W5單倍體的制備結(jié)果Fig.1 Preparation results of Saccharomyces cerevisiae W5 haploid

2.2 單倍體菌株代謝水平分析結(jié)果

將S.cerevisiaeZ5（MAT-α）與S.cerevisiaeW5（MATa/α）分別按5%接種量接種到搖瓶葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，每12 h取一次樣進(jìn)行HPLC測定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著菌體的大量繁殖，二者的葡萄糖消耗量均不斷增加，菌株Z5生長速率略低于W5，但二者差異不顯著（P＞0.05）。與此同時，菌株Z5的乙醇含量在36 h時達(dá)到最大值為（37.66±1.34）g/L，較菌株W5在24 h時達(dá)到的最大值（48.65±2.39）g/L下降了22.59%（圖2A）。其他支路產(chǎn)物的變化卻有所不同（圖2B）：在發(fā)酵前24 h這段期間，菌株Z5的甘油質(zhì)量濃度均較菌株W5低，但是在發(fā)酵第36小時時，菌株Z5的甘油含量為（4.44±0.06）g/L較菌株W5［（2.64±0.07）g/L］提高了40.54%（P＜0.05），隨后二者的甘油質(zhì)量濃度又趨于一致。與此同時，菌株Z5的乙酸和乙偶姻質(zhì)量濃度也均在36 h時達(dá)到最大值，分別為（5.10±0.10）g/L和（0.30±0.01）g/L，較菌株W5在24 h時達(dá)到的最大值（3.23±0.15）g/L和（0.18±0.01）g/L分別提高了57.89%和66.67%（P＜0.05），而二者的OD600nm值差異卻不顯著（P＞0.05）。

理論上在發(fā)酵24 h時S.cerevisiae的乙酸產(chǎn)量顯著升高，必定會造成發(fā)酵液中的pH值迅速下降，但在整個發(fā)酵過程中二者的pH值變化并不顯著（P＞0.05）。原因在于S.cerevisiae在生長代謝過程中，有維持細(xì)胞酸堿平衡的物質(zhì)產(chǎn)生，如2,3-丁二醇（2,3-butanediol，2,3-BD），而實驗中并未檢測到2,3-BD的產(chǎn)生，但卻檢測到了2,3-BD的前體物質(zhì)乙偶姻的變化，分析可能是由于菌株中積累的2,3-BD被用來中和酸性物質(zhì)，從而維持了細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，但由于積累量不高致使HPLC并未檢測到。而甘油的濃度變化可能是由于菌株的乙酸代謝能力的上升所造成的，此時甘油被用于維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓的平衡，由于菌株Z5的生長速率較菌株W5慢，所以造成了到第36小時時，菌株Z5的甘油濃度較菌株W5提高了40.54%。與此同時，將該菌株的發(fā)酵代謝特性與實驗室先前獲得的MAT-a型單倍體菌株H14進(jìn)行了比較：在相同的發(fā)酵條件下，菌株Z5在發(fā)酵第36小時時，才達(dá)到最大乙醇代謝質(zhì)量濃度（37.66±1.34）g/L與菌株H14在發(fā)酵第30小時時最大乙醇代謝質(zhì)量濃度（40.46±1.06）g/L相比，差異顯著（P＜0.05），且時間上有明顯的延遲。但是菌株Z5的乙酸和乙偶姻的代謝強(qiáng)度明顯比菌株H14高，存在著較大的代謝差異性[26]。分析這一結(jié)果可能是由于S.cerevisiae二倍體在減數(shù)分裂過程中，同源染色體間會發(fā)生部分交換后，導(dǎo)致基因的表達(dá)量不同所造成的。

圖2 釀酒酵母W5和Z5的代謝產(chǎn)物測定結(jié)果Fig.2 Metabolite measurement results of Saccharomyces cerevisiae W5 and Z5

2.3 代謝關(guān)鍵酶活性的檢測結(jié)果

樣品的可溶性蛋白含量常用于關(guān)鍵酶活性測定，利用BCA法每隔12 h對兩株S.cerevisiae的Cpr進(jìn)行測定。發(fā)現(xiàn)二者的Cpr均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢（圖2A），并且在12 h時二者的Cpr均達(dá)到最高分別為：菌株W5的（4.76±0.14）g/L和菌株Z5的（4.48±0.02）g/L，最后在36h時菌株W5的Cpr降至（0.82±0.03）g/L，而菌株Z5則在48 h時降至（0.36±0.01）g/L。

由圖3可知，S.cerevisiaeZ5（MAT-α）與S.cerevisiaeW5（MATa/α）的PDC酶活力、ADH酶活力、ILV2酶活力和BDH1酶活力，均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。在發(fā)酵第36小時時，菌株Z5的PDC酶活力和ADH酶活力達(dá)到最大值分別為（0.52±0.01）U/mg和（0.29±0.01）U/mg，與菌株W5［（0.51±0.01）U/mg和（0.33±0.01）U/mg，24 h］相比，PDC酶活力差異不顯著（P＞0.05），但ADH酶活力明顯下調(diào)了12.12%（P＜0.05）。在發(fā)酵60h時，菌株Z5的ILV2酶活力和BDH1酶活力均達(dá)到最大值分別為（0.05±0.01）U/mg和（0.04±0.01）U/mg，與菌株W5［（0.04±0.01）U/mg和（0.03±0.01）U/mg］相比，ILV2酶活力顯著上調(diào)25.0%（P＜0.05），BDH1酶活力則顯著上調(diào)33.33%（P＜0.05）。

圖3 釀酒酵母W5和Z5的代謝關(guān)鍵酶活性測定結(jié)果Fig.3 Determination results of key enzyme activities of Saccharomyces cerevisiae W5 and Z5

由于S.cerevisiaeZ5（MAT-α）的生長速率較S.cerevisiaeW5（MATa/α）慢，所以也就造成了二者代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶酶活力之間存在時間差。菌株Z5的PDC酶活力較W5沒有很大的差異，但ADH酶活力卻明顯下調(diào)了12.12%，這一結(jié)果為HPLC檢測到的菌株Z5乙醇代謝產(chǎn)量較W5低，而乙酸產(chǎn)量卻明顯上升，提供了有力證據(jù)。與此同時，菌株Z5的ILV2酶活力與BDH1酶活力較菌株W5顯著上調(diào)了25.0%和33.33%，進(jìn)一步佐證了菌株Z5的乙偶姻產(chǎn)量較菌株W5上升了66.67%這一檢測結(jié)果，也為2,3-BD存在的可能，提供了數(shù)據(jù)支撐。分析造成以上結(jié)果的原因：由于細(xì)胞配型的改變，造成了菌株Z5的發(fā)酵性能較原始菌株W5發(fā)生了較大的改變，乙醇代謝能力降低，而乙偶姻和乙酸等代謝副產(chǎn)物的合成途徑卻明顯增強(qiáng)，這些代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生，也才使得單倍體菌株較二倍體菌株能夠耐受更加嚴(yán)苛的發(fā)酵環(huán)境[10]。

3 結(jié)論

本實驗采用隨機(jī)孢子分析法、MAT-PCR法及連續(xù)傳代培養(yǎng)等方法，獲得了一株理想的，遺傳穩(wěn)定性高且代謝特征明顯的單倍體S.cerevisiaeZ5（MAT-α）。利用HPLC檢測其代謝產(chǎn)物的變化情況，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeZ5較二倍體S.cerevisiaeW5乙醇最大質(zhì)量濃度下降了22.59%（P＜0.05），而乙酸和乙偶姻的產(chǎn)量卻分別提高了57.89%、66.67%（P＜0.05）。此外，對其四個代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶酶活力的檢測也進(jìn)一步佐證了HPLC的檢測結(jié)果。間接證明了S.cerevisiae倍性的改變在一定程度上對其代謝流向產(chǎn)生了影響，使得菌株Z5乙醇最大質(zhì)量濃度較W5下降，而使丙酮酸流向乙偶姻（或2,3-BD前體物質(zhì)）的代謝流向變強(qiáng)。與此同時，由菌株W5分化產(chǎn)生的MAT-α和MAT-a型的單倍體菌株，他們的各自的代謝特征有著很大的不同。