汪 陽，薛 晶，趙潔雅，汪 萍，沈辰峰，苗書魁，梁紀元，馬文戈，張 楊，夏 俊*，杜 瑋*

(1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆畜牧科學院，新疆 烏魯木齊 830000)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)原名溶血性巴氏桿菌(Pasteurellahaemolytica)，棲息在鼻咽部與宿主保持一種共生的關系[1-2]，是引起運輸熱(shipping fever)即牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)的病原之一，具有全球分布性[3]。溶血性曼氏桿菌是一種機會致病菌，當宿主因運輸、環(huán)境等應激或感染呼吸道病毒或支原體(Mycoplasma bovis，M.bovis)導致抵抗力下降時，該菌會通過呼吸道漿液性和黏液性分泌物從共生狀態(tài)被釋放出[4]，從而侵襲宿主肺部引起呼吸道疾病[2,5]。近年來由溶血曼氏桿菌引起牛、羊急性肺炎及敗血癥不斷增多，給牛、羊養(yǎng)殖業(yè)帶來較大危害。2019年10月，新疆某規(guī)模化牛場陸續(xù)發(fā)生了由于長途運輸導致牛運輸綜合征的疑似病例，此批牛在運輸途中及到場后發(fā)病死亡，病牛體溫升高至41～41.5 ℃、咳嗽、呼吸困難、流鼻涕，病程短、死亡快(1～5 d)，先后死亡10余頭。剖檢急性死亡?？梢娦耐饽?、心冠脂肪出血，肺臟嚴重充血、出血，纖維素性肺炎，肝臟、膽囊腫大，但脾臟不腫大。為了確定引起該病的病原，本研究無菌采集了病死牛心臟、肺臟等病變組織進行細菌的分離鑒定，并對分離菌的生物學特性進行分析，為進一步探討溶血曼氏桿菌的致病機制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 心血及肺臟組織，采自新疆某牛場新購進的病死牛。

1.1.2 主要試劑 腦心浸液肉湯(BHI)購自北京奧博星生物技術有限公司；革蘭氏染色液購自北京索萊寶科技有限公司；細菌微量生化反應管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗動物 18～22 g健康巴貝斯小鼠購自新疆維吾爾自治區(qū)疫病預防與控制中心動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 取心血及肺臟病變組織在無菌環(huán)境下接種于BHI液體培養(yǎng)基上，置于37 ℃水平搖床(150 r/min)進行增菌培養(yǎng)，并將肺臟病變組織于無菌條件下切取一小塊涂抹于BHI固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。24 h后將菌液進行革蘭氏染色鏡檢，然后將固體平板上的單菌落挑出再接種于BHI液體培養(yǎng)基上，置于37 ℃水平搖床(150 r/min)進行培養(yǎng)并觀察細菌的生長狀況，分離株命名為XJMA1-1。

1.2.2 生化鑒定試驗 無菌操作臺內將生化鑒定管上端用砂輪劃痕折斷，與酒精燈火焰消毒，然后用接種環(huán)將純化的細菌培養(yǎng)物接種于 D-葡萄糖、D-麥芽糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-乳糖、D-木糖、靛基質、脲酶、吲哚等微型生化鑒定管，置滅菌平皿內或小試管架上，放于37 ℃培養(yǎng)箱內，按規(guī)定時間觀察記錄結果。

1.2.3 PCR鑒定 所用引物為溶血性曼氏桿菌鑒定引物，以及溶血性曼氏桿菌血清型A1型引物、A2型引物、A6型引物進行PCR鑒定，PCR反應體系50 μL進行PCR擴增：

其中2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，模板2 μL，超純水補至50 μL[6]，離心混合均勻后置PCR擴增儀中。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃循環(huán)變性30 s，56 ℃退火復性30 s，72 ℃延伸40 s，進行30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，最后4 ℃保存。反應結束后，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，參照標準DNA 2000 Marker，對待檢樣品目的DNA片段進行鑒定。用瓊脂凝膠回收試劑盒將PCR產物回收后，送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.4 毒力因子檢測 對分離株進行16SRNA、core、9s6、lkt、lk、p1p、Hy、dna、T、fbp、tbp等毒力基因檢測，PCR反應體系及方法同1.2.3。

1.2.5 致病性試驗 選取健康的巴貝斯小鼠，試驗前7 d，觀察小鼠食欲、精神狀況，確保小鼠食欲、精神正常的情況下將分離株分別腹腔注射200 μL 4只小鼠，另外4只小鼠作為空白對照，并隨時觀察小鼠的食欲和精神狀況。

1.2.6 藥敏試驗 按常規(guī)紙片法進行藥敏試驗，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結果

2 結果與分析

2.1 細菌形態(tài)及培養(yǎng)特性

在病料及培養(yǎng)物涂片后，革蘭氏鏡檢可見球狀或桿狀、兩端鈍圓，呈單個、成對散在排列的革蘭氏陰性球桿菌(圖1)。從心血、肺臟分離的菌株在BHI固體培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈圓形、光滑、濕潤、灰白色的小菌落(圖2)。

圖1 革蘭氏染色鏡檢

圖2 BHI固體培養(yǎng)基

2.2 生化鑒定試驗結果

生化試驗結果(表1)顯示，分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、木糖等碳水化合物，不發(fā)酵脲酶和吲哚，產生少量酸而不產氣，符合溶血曼氏桿菌生化特性。

表1 生化鑒定試驗結果

2.3 PCR鑒定結果及分析

用曼氏桿菌鑒定引物，以及曼氏桿菌血清型A1型引物、A2型引物、A6型引物進行PCR擴增，結果顯示，4株菌均為曼氏桿菌A1型(圖3)。

圖3 PCR擴增結果圖

2.4 毒力因子檢測結果及分析

用16SRNA、core、9s6、lkt、lk、p1p、Hy、dna、T、fbp、tbp基因引物進行PCR擴增結果顯示，該菌株在16SRNA、9s6、lkt、lk、Hy、dna、fbp基因擴增出600、170、440、180、440、170、160的條帶(圖4)，與預期片段相符。

圖4 溶血性曼氏桿菌毒力基因檢測

2.5 致病性實驗結果

攻毒后小鼠連續(xù)觀察4 h后，出現(xiàn)精神沉郁，被毛粗亂，18 h后小鼠陸續(xù)死亡(圖5)。

圖5 溶血性曼氏桿菌小鼠攻毒試驗

2.6 藥敏實驗結果

藥敏實驗結果表明，溶血性曼氏桿菌分離株對左氧氟沙星、氟本尼考、替米考星高度敏感，對頭孢曲松鈉、阿奇霉素、乳酸環(huán)丙沙星中度敏感，對硫酸阿米卡星、鹽酸林可霉素、克林霉素、硫酸慶大霉素不敏感。

3 討論

溶血性曼氏桿菌是引起牛運輸熱的主要病原之一[7-8]。近年來，隨著新疆養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，各地頻繁調運牛，由運輸應激引發(fā)病原感染造成調運牛死亡病例日趨增多，給牛的調運帶來較大的經濟損失[9-10]。但由溶血性曼氏桿菌引發(fā)調運牛發(fā)病死亡的確診報道及對病原的生物學特性分析在新疆鮮有報道。本試驗從發(fā)生急性敗血癥死亡牛的病變組織中分離到革蘭氏陰性短桿菌，病料涂片瑞氏染色可見兩極濃染及明顯的莢膜，細菌在腦心浸液肉湯(BHI)固體培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈圓形、光滑、濕潤、灰白色小菌落。生化試驗結果顯示，分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖和木糖等碳水化合物，不發(fā)酵脲酶和吲哚，與馮旭飛等[11]報道基本一致，符合溶血性曼氏桿菌的生化反應特性。通過PCR鑒定試驗發(fā)現(xiàn)，分離菌與溶血性曼氏桿菌的同源性高達99%，表明分離株均為溶血性曼氏桿菌。溶血性曼氏桿菌共有12個血清型，其中A1和A2血清型是優(yōu)勢菌株，A1血清型是牛運輸熱的主要病原，A2血清型是引起綿羊發(fā)病的最常見的血清型，也有報道認為其他血清型的菌株也與疾病的發(fā)生有關。通過血清型基因序列比對發(fā)現(xiàn)，分離菌與A1型溶血曼氏桿菌的同源性高達98%以上，表明分離株為A1型溶血曼氏桿菌。國內對血清型鑒定菌株的研究極少。因此有必要進一步研究該分離株的致病性，為牛、羊感染溶血性曼氏桿菌的控制提供依據(jù)。

4 結論

本試驗對引起牛運輸熱的病原進行分離鑒定，經細菌形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)該菌為兩端鈍圓，呈單個或成對散在排列的革蘭氏陰性球桿菌；生化鑒定結果顯示該菌不發(fā)酵脲酶和吲哚，產生少量酸而不產氣，符合曼氏桿菌的生化特性。經形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化鑒定、PCR鑒定及PCR分型鑒定確定該分離菌株為A1型溶血性曼氏桿菌。使用藥敏紙片，將該分離菌株進行藥敏實驗，發(fā)現(xiàn)其對左氧氟沙星、氟本尼考、替米考星高度敏感，對頭孢曲松鈉、阿奇霉素、乳酸環(huán)丙沙星中度敏感，對硫酸阿米卡星、鹽酸林可霉素、克林霉素、硫酸慶大霉素不敏感。小鼠致病性實驗結果證明該菌株對健康小鼠有一定的致病能力。