傅錦堅(jiān)，陳繼昌，肖 萍

(1.柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西 柳州 545001； 2.柳州市婦幼保健院新生兒科，廣西 柳州 545001; 3.柳州市婦幼保健院藥學(xué)部， 廣西 柳州 545001)

B族鏈球菌(Group BStreptococcus，GBS)是引起新生兒敗血癥和腦膜炎的主要病原體[1-3]。據(jù)估計(jì)，10%～30%的妊娠期婦女直腸陰道定植有GBS，而母體攜帶GBS是新生兒感染的主要來源[4]。在沒有任何干預(yù)的情況下，GBS定植的母親娩出的新生兒中有1%～2%可有嚴(yán)重性的感染，如敗血癥或腦膜炎等[4]。新生兒GBS疾病是分娩期間由母親-新生兒的垂直傳播或由醫(yī)護(hù)人員的水平傳播引起的[5]。在0～6日齡新生兒中發(fā)生的感染被稱為早發(fā)型，在7～90日齡新生兒中發(fā)生的感染被稱為晚發(fā)型；膿毒癥和肺炎常見于早發(fā)型，而腦膜炎和菌血癥在晚發(fā)型中更常見[6]。研究者已開發(fā)多種技術(shù)去更好地理解GBS的種群結(jié)構(gòu)，其中多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是標(biāo)準(zhǔn)的分型方法[7-8]。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，分離自不同國家不同人群的GBS菌株的MLST結(jié)果表明，只有少數(shù)的克隆復(fù)合體(clonal complex，CC)，包括CC1、CC10、CC17、CC19和CC23與GBS的定植或侵襲性感染有關(guān)[9]。在上述CC中，CC17是一種高毒力克隆，主要與新生兒的侵襲性疾病有關(guān)；CC19可引起新生兒或成人的侵襲性疾病[10]。最近的研究結(jié)果表明，母體或新生兒定植的菌株中，CC1、CC19和CC23的分離比例非常高[10]。研究結(jié)果表明，CC17是莢膜型別(CT)Ⅲ的同質(zhì)克隆復(fù)合體，不同的CC表達(dá)的莢膜型別不一致[8-10]。多糖莢膜是GBS最重要的毒力因子，基于表面多糖結(jié)構(gòu)的差異，研究者已將其分為10種CT(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ—Ⅸ)，被稱為10種血清型[8-10]。由于西部地區(qū)研究新生兒GBS定植的調(diào)查報(bào)道較少，因此，本研究旨在分析柳州地區(qū)新生兒定植的GBS菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性、血清分型和分子特征。

1 資料與方法

1.1 研究人群和樣本收集

本研究對(duì)日常監(jiān)測(cè)樣本進(jìn)行采樣。凡是2015年1月至2020年4月在柳州市婦幼保健院出生的新生兒，在母親采集樣本進(jìn)行GBS分析的情況下，對(duì)娩出的新生兒出生后立即用無菌取樣器涂抹耳朵、口腔和臍帶后放置運(yùn)送培養(yǎng)基送檢。上述樣本監(jiān)測(cè)和采集的過程，獲得柳州市婦幼保健院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批件號(hào)為20170010)。

1.2 GBS的分離鑒定

取出采樣拭子，將其接種于GBS鑒定顯色平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)中，5%CO2、37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，挑選粉色、紫色、紅色等可疑陽性菌落進(jìn)行革蘭染色、形態(tài)學(xué)和過氧化氫酶等鑒定，再進(jìn)行CAMP試驗(yàn)，觀察溶血模式，確定分離株為GBS。

1.3 藥物敏感試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)

使用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，折點(diǎn)和抗菌藥物紙片的選擇基于美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)提出的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。對(duì)以下抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，包括青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、克林霉素、紅霉素、氯霉素、利奈唑胺和萬古霉素。多重耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)為菌株對(duì)≥3種不同型別的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。此外，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法用于檢測(cè)四環(huán)素耐藥基因(tetM、tetO、tetL、tetK、tetT和tetS)、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(ermA、ermB、ermTR和mefA/E)和林可酰胺類耐藥基因(linB)[11]。

1.4 GBS的分子特征分析

采用MLST方法對(duì)GBS的7個(gè)管家基因進(jìn)行測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果通過MLST的數(shù)據(jù)庫(http://eburst.mlst.net)查詢得出序列分型(sequence type，ST)和等位基因。使用網(wǎng)站自帶程序eBURST確定特定ST的CC，單ST指未能聚集成CC的ST。使用PCR方法對(duì)GBS攜帶的10種血清型別進(jìn)行鑒定，并對(duì)GBS的毒力基因，如黏附相關(guān)基因(scpB)、入侵相關(guān)基因(hlyB)和alp表面定位蛋白抗原基因(alphaC、rib、epsilon、alp2/3和alp4)進(jìn)行分型分析，所有的鑒定參照相關(guān)文獻(xiàn)[11]中方法進(jìn)行處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 新生兒GBS定植的臨床特征

新生兒平均住院時(shí)間為(7.18±11.89)d。共檢出50株GBS，其中，男性新生兒檢出28株(占56.0%)；初產(chǎn)分娩新生兒檢出26株(占52.0%)；順產(chǎn)新生兒檢出19株(占18.0%)；發(fā)生肺炎、窒息的新生兒分別檢出16、4株(分別占32.0%、8.0%)，見表1。

表1 新生兒GBS定植的臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of neonatal GBS colonization

2.2 新生兒GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關(guān)系

50例GBS菌株中，80.0%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥性；所有GBS菌株均對(duì)青霉素、頭孢曲松、利奈唑胺和萬古霉素敏感，均對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥；60.0%的菌株同時(shí)攜帶紅霉素和四環(huán)素的耐藥基因，主要的耐藥基因?yàn)閑rmA和tetM；GBS菌株的血清型主要為Ⅰa型(21株，占42.0%)、Ⅲ型(21株，占42.0%)和Ⅰb型(8株，占16.0%)；所有的菌株均攜帶毒力基因scpB和hlyB。不同血清型攜帶的基因不一致，例如，血清型Ⅰa型菌株中，攜帶耐藥基因tetT的菌株數(shù)所占比例最高(8株，占38.1%)(P=0.005)；血清型Ⅲ型菌株中，攜帶alp表面定位蛋白抗原基因rib的菌株數(shù)所占比例最高(14株，占66.7%)(P<0.001)；血清型Ⅰa型菌株中攜帶alphaC的菌株數(shù)所占比例遠(yuǎn)高于血清型Ⅰb型和Ⅲ型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。新生兒GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關(guān)系見表2。

2.3 新生兒GBS菌株克隆型、血清型和耐藥基因、毒力基因的特征

50株GBS菌株中，最常見的基因序列類型為ST12型(15株，占30.0%)、ST19型(10株，占20.0%)、ST17型(9株，占18.0%)和ST23型(5株，占10.0%)。ST17型和ST19型主要與血清型Ⅲ型有關(guān)，對(duì)四環(huán)素、紅霉素和克林霉素耐藥，攜帶有耐藥基因tetM和ermA，毒力基因rib；ST12型和ST23型主要與血清型Ⅰa型有關(guān)，攜帶有耐藥基因tetM和ermA，毒力基因alphaC和epsilon。新生兒GBS菌株克隆型、血清型和耐藥基因、毒力基因的特征見表3。

表2 新生兒GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關(guān)系Tab 2 Correlation between drug resistance, virulence gene and serotypes of neonatal GBS strains

3 討論

青霉素是推薦用于預(yù)防和治療GBS疾病的一線藥物。本研究中，所有GBS分離株均對(duì)青霉素敏感，這表明青霉素仍是預(yù)防用藥的首選，與最新的薈萃分析結(jié)果相似[12]。指南推薦，若對(duì)青霉素過敏，建議使用紅霉素和克林霉素作為替代藥物。但本研究結(jié)果顯示，所有的50株GBS菌株均對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥,與以往的研究結(jié)果相似[13]。此外，最新的薈萃分析結(jié)果亦表明，亞洲國家分離的GBS菌株對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率高于非亞洲國家[12]。上述研究結(jié)果表明，使用抗菌藥物對(duì)新生兒進(jìn)行預(yù)防性用藥時(shí)，需要在藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果的指導(dǎo)下進(jìn)行，尤其是對(duì)于青霉素過敏的新生兒。本研究中，80.0%的GBS菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，主要對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素耐藥。與本研究結(jié)果類似的一篇來自中國新生兒侵襲性GBS菌株研究結(jié)果顯示，79.9%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，主要對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素耐藥[14]。上述結(jié)果凸顯了臨床實(shí)驗(yàn)室持續(xù)監(jiān)測(cè)GBS菌株對(duì)抗菌藥物耐藥性的重要性。

表3 新生兒GBS菌株克隆型、血清型和耐藥基因、毒力基因的特征Tab 3 Characteristics of clonotype, serotype, drug resistance gene and virulence gene of neonatal GBS isolates

較少有研究報(bào)道GBS菌株的耐藥機(jī)制。erm基因是主要的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因，通過甲基化修飾核糖體并抑制紅霉素結(jié)合，達(dá)到對(duì)紅霉素耐藥的目的，而mef基因編碼充當(dāng)藥物外排泵的膜蛋白，將抗菌藥物往外排。本研究中，8株GBS菌株同時(shí)攜帶ermB、ermA和(或)mefA/E，表明GBS對(duì)紅霉素的耐藥性主要通過上述2種機(jī)制介導(dǎo)。鏈球菌中四環(huán)素的耐藥性主要是由tetM、tetO或tetT基因編碼的核糖體保護(hù)蛋白介導(dǎo)的，由tetK或tetL基因編碼介導(dǎo)的外排機(jī)制相對(duì)罕見[15]。本研究結(jié)果與之類似，有70.0%的菌株至少攜帶1種上述耐藥基因。最為重要的是，60.0%的菌株同時(shí)攜帶紅霉素和四環(huán)素耐藥基因，主要的耐藥基因?yàn)閑rmA和tetM。上述耐藥基因的存在可能是耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的結(jié)果，未來的研究必須更多地關(guān)注GBS菌株對(duì)抗菌藥物耐藥的遺傳機(jī)制。

已有研究報(bào)道，可通過研究開發(fā)針對(duì)GBS血清型的疫苗對(duì)GBS疾病進(jìn)行預(yù)防。疫苗的研發(fā)取決于人群監(jiān)測(cè)中GBS血清型分布的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。本項(xiàng)針對(duì)新生兒群體的研究數(shù)據(jù)顯示，42.0%的血清型集中在Ⅰa型，另外42.0%的血清型集中在Ⅲ型，16.0%血清型為Ⅰb型，與廣州市新生兒GBS菌株的分子特征相似[16]。目前正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)為三價(jià)(Ⅰa型、Ⅰb型和Ⅲ型)GBS疫苗[11]，在不久的將來，按照現(xiàn)在的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，若能在我國投放使用，將能很好地覆蓋新生兒人群。但也有研究結(jié)果顯示，在不同的國家，流行的主要血清型別不一致，如在韓國主要流行的血清型為Ⅲ型和Ⅴ型[17]。上述研究結(jié)果顯示，不同的國家，由于地理位置、種族、人群不一致，GBS的血清型分布亦存在時(shí)間、空間和人群的差異性[18-21]。未來仍需繼續(xù)對(duì)妊娠期、圍產(chǎn)期婦女和新生兒定植和感染的GBS菌株進(jìn)行持續(xù)性監(jiān)測(cè)，以方便獲取GBS的遺傳背景和血清學(xué)信息，用于下一步疫苗的研制。

本研究從50株GBS定植菌株中分離鑒定出11種ST，其中最常見的ST為ST12、ST19、ST17和ST23，占全部菌株的78.0%。本研究共鑒定出6種CC，分別為CC10、CC12、CC17、CC19、CC23和CC103，其也是全球最常見的CC。已有研究結(jié)果認(rèn)為，ST19/Ⅲ與定植有關(guān)，而ST17/Ⅲ主要與侵襲性感染有關(guān)[11]。在致病菌株中，最常見的CC是CC17，其對(duì)應(yīng)的血清型為Ⅲ型。據(jù)報(bào)道，由于其高致病性和毒力，CC17最常引起新生兒腦膜炎，尤其是免疫系統(tǒng)尚未成熟的嬰幼兒。在新生兒侵襲性感染的發(fā)生和發(fā)展過程中，CC17菌株通過特殊的毒力機(jī)制增強(qiáng)了GBS的致病性和侵襲性，這是>80%的患兒發(fā)生腦膜炎的主要原因[10]。CC17定植是新生兒GBS感染的主要危險(xiǎn)因素[16]。荷蘭的一項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1987—2011年，GBS感染發(fā)生率升高的主要原因是CC17的流行率升高[22]。本研究中發(fā)現(xiàn)9株ST17菌株，屬于定植菌株而非感染菌株。CC17和CC19是GBS血清型Ⅲ型最常見的重要基因譜系，因此，Ⅲ型可能是導(dǎo)致嬰兒GBS定植的最常見血清型。此前的研究結(jié)果顯示，盡管進(jìn)行了產(chǎn)前抗菌藥物預(yù)防性用藥，血清型Ⅲ型的ST17和ST19克隆在產(chǎn)后8周仍可檢測(cè)出來[23]，可以部分解釋為何產(chǎn)前進(jìn)行了抗菌藥物預(yù)防性用藥，仍有部分菌株可引起新生兒的侵襲性感染。

此外，本研究結(jié)果顯示，在GBS菌株中存在著特定的血清型-遺傳背景-毒力基因-耐藥基因的組合，如ST17-Ⅲ型-ermA-rib，ST19-Ⅲ型-linB-tetM-rib-epsilon和ST12-Ⅰa型/Ⅰb型-ermA-linB-alphaC等。值得注意的是，本研究中發(fā)現(xiàn)，GBS毒力基因rib和alphaC存在于特定的克隆和血清型菌株中，如alphaC僅存在于ST12菌株中，而所有ST12菌株的血清型均為Ⅰ型(Ⅰa型和Ⅰb型)。rib僅存在CC17和CC19中，這2個(gè)克隆均屬于血清型Ⅲ型。上述研究結(jié)果提示，在調(diào)查GBS的分子特征時(shí)，需要綜合考慮GBS的特定蛋白，以便發(fā)現(xiàn)新的流行病學(xué)趨勢(shì)，并在以后的疫苗研發(fā)中加以考慮和應(yīng)用。

綜上所述，本研究運(yùn)用多種方法鑒定了新生兒定植性GBS菌株的耐藥表型、耐藥基因型、血清型、毒力基因和遺傳背景分析，并發(fā)現(xiàn)GBS的遺傳背景具有一定的特異性，凸顯了在以后的研究中仍需對(duì)日常監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)的GBS菌株加以鑒定分析，以期發(fā)現(xiàn)新的流行病學(xué)趨勢(shì)，并在日后研發(fā)多價(jià)GBS疫苗中加以考慮和應(yīng)用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，從新生兒群體中分離的GBS菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，凸顯了日后持續(xù)監(jiān)測(cè)GBS耐藥性的重要性。