謝 平，陳 丹，熊朝棟，余文靜，劉永靜

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.）為葡萄科崖爬藤屬植物，是我國特有的珍稀藥用植物、民間常用藥。 研究表明三葉青具有抗腫瘤、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［1-3］。三葉青藤葉配方顆粒是以其飲片為原料經(jīng)水煎煮、濃縮、噴霧干燥、制粒等工藝制備而成，即沖即飲，攜帶方便。 藥物穩(wěn)定性研究是質(zhì)量控制的主要組成部分，藥物需要有一定的穩(wěn)定性才能確保在生產(chǎn)、流通和貯藏中的質(zhì)量。 通過考察藥物在各種環(huán)境因素如溫度、濕度等的影響下隨時間的變化規(guī)律，為藥物的生產(chǎn)、包裝、貯藏條件的確定提供科學依據(jù)，保障用藥的安全有效［4］。 因此，實驗根據(jù)“中藥、天然藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導原則”［5］，采用已建立的三葉青藤葉配方顆粒質(zhì)量標準，以聚酰胺薄層色譜法鑒別三葉青藤葉配方顆粒，并對配方顆粒進行水分檢查；采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，以主要代表性成分異葒草苷為對照，測定其總黃酮含量；并以高效液相色譜法（HPLC 法）同時測定三葉青藤葉配方顆粒中特征效應(yīng)組分群含量［6-8］；通過影響因素試驗及常溫3 個月初步穩(wěn)定性試驗，考察三葉青藤葉配方顆粒的穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA 檢測器、Empower 3 色譜工作站［沃特世科技（上海）有限公司］；AR2140 萬分之一電子天平、XS205 十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；UV-4802 型雙光束紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；TDL-40B 型低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；Yoko-PN 電動噴霧器（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司）；ZF1-Ⅰ型多功能紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥 三葉青藤葉飲片由福州集珍園生物科技有限公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室范世明高級實驗師鑒定。 三葉青藤葉配方顆粒（自制，批號：20160418、20160419、20160420）；新綠原酸對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-16021806，含量≥98%）；綠原酸對照品（批號：110753-201612，含量≥98%）、葒草苷對照品（批號：111776-201302，含量≥98%）、異葒草苷對照品（批號：111974-201401，含量≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷對照品（自制，含量≥98%）；聚酰胺薄膜（浙江臺州路橋四甲生化塑料廠）；甲醇為色譜純；36%乙酸等其余試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 考察項目的確定 取三葉青藤葉配方顆粒三批，分別考察其外觀性狀、氣味及色澤等；薄層色譜法鑒別，觀察在對照品綠原酸、異葒草苷和異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷顯色斑點位置，供試品是否有相同顏色的熒光斑點出現(xiàn)；檢查配方顆粒水分限量是否低于8%；主組成分異葒草苷為對照，亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定配方顆粒總黃酮含量；HPLC法同時測定新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷和異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷效應(yīng)組分群含量；以三批樣品實驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)并結(jié)合藥材含量及工藝收率綜合分析制定含量限度。

2.2 性狀 三葉青藤葉配方顆粒應(yīng)為黃棕色至深棕色顆粒，氣香，色澤均勻。

2.3 三葉青藤葉配方顆粒薄層色譜法鑒別

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 綠原酸的溶液，搖勻，即得；精密稱取異葒草苷對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含0.5 mg 異葒草苷的溶液，搖勻，即得；精密稱取異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷的溶液，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 三葉青藤葉飲片供試品溶液的制備，稱取三葉青藤葉飲片粉末1 g，加水適量提取1 h，濾過，濾液蒸干，加甲醇25 mL 超聲溶解，即得。 三葉青藤葉配方顆粒供試品溶液的制備，稱取三葉青藤葉配方顆粒0.5 g，加甲醇25 mL 超聲溶解，即得。

2.3.3 薄層色譜法鑒別 分別吸取綠原酸對照品溶液、異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷對照品溶液、異葒草苷對照品溶液、三批三葉青藤葉配方顆粒供試品溶液、三葉青藤葉飲片對照溶液各2 μL，點于同一聚酰胺薄膜上，以36%乙酸為展開劑，飽和20 min后展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，于105 ℃加熱 5 min，置于 365 nm 紫外燈下檢視［8］。 觀察在對照品斑點出現(xiàn)的相應(yīng)位置，供試品溶液是否有相同顏色的熒光斑點出現(xiàn)。 結(jié)果見圖1。

圖1 三葉青藤葉配方顆粒、中間體、飲片薄層色譜圖

2.4 水分檢查 精密稱取三葉青藤葉配方顆粒2.0 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，每批平行測定3 份，按《中華人民共和國藥典（四部）》（2015 年版）通則“0832 水分測定法”的第二法（烘干法）［9］測定，計算供試品中含水量。

2.5 三葉青藤葉配方顆?？傸S酮含量測定

2.5.1 對照品溶液制備 精密稱取異葒草苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.193 2 mg 異葒草苷的溶液，搖勻，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取三葉青藤葉配方顆粒約0.2 g，置25 mL 量瓶中，加30%甲醇超聲溶解，放置至室溫后，用30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.3 標準曲線制備及線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液 1、2、3、4、5、6 mL，置 25 mL 容量瓶中，加甲醇至6 mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再精密加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，精密加入4%氫氧化鈉試液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻放置15 min，以空白溶劑及顯色劑為參比，在500 nm 波長處測定吸光度，以濃度 C（μg／mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線［8］。 實驗結(jié)果表明：異葒草苷在 7.73～61.82 μg／mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為 A＝1.41×10-2C－4.3×10-3（r＝0.999 9）。

2.5.4 樣品含量測定 精密稱取配方顆粒0.2 g，按“2.5.2”“2.5.3”項下同法操作、顯色，在 500 nm 波長處測定供試品溶液吸光度，計算總黃酮含量。

2.6 HPLC 法同時測定三葉青藤葉配方顆粒中5個效應(yīng)組分含量

2.6.1 混合對照品溶液制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷對照品適量，加適量甲醇超聲溶解，放置室溫，用甲醇制成新綠原酸質(zhì)量濃度為0.093 0 mg／mL、綠原酸質(zhì)量濃度為0.205 0 mg／mL、葒草苷質(zhì)量濃度為0.046 0 mg／mL、異葒草苷質(zhì)量濃度為 0.105 0 mg／mL、異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷質(zhì)量濃度為0.189 0 mg／mL 的混合對照品溶液。

2.6.2 供試品溶液制備 精密稱取三葉青藤葉配方顆粒約0.2 g，置25 mL 容量瓶中，加30%甲醇超聲溶解，放置至室溫后，用30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗及測定法 色譜柱 250-4 Lichrocart C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.5%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～10 min，20%A；10 ～15 min，20%A →25%A；15～20 min，25%A→33.5%A；20～23 min，33.5%A；23～30 min，33.5%A→40%A；30～40 min，40%A→20%A）；流速 1.0 mL／min；檢測波長 340 nm；柱溫40 ℃；進樣量 10 μL［8］。 新綠原酸、綠原酸、葒草苷、異葒草苷、異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷對照品在規(guī)定色譜條件下，各色譜峰分離度（R）＞1.5，理論塔板數(shù)按綠原酸計不得低于3 000。 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測量色譜峰面積，外標法計算各效應(yīng)組分含量。 結(jié)果見圖2。

2.6.4 標準曲線制備與線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 mL，分別置10 mL 容量瓶中，30%甲醇稀釋至刻度，搖勻。 分別精密吸取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，以濃度 C（μg／mL）為橫坐標，峰面積 A 為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。 實驗結(jié)果表明：新綠原酸在 2.325～93.000 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y＝2.017 6×104x＋5.147 2×103，r＝0.999 9；綠原酸在 5.125～205.000 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍呈良好線性關(guān)系，回歸方程為 y＝2.221 4×104x＋9.601 0×103，r＝0.999 9；葒草苷在1.150～46.000 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y＝2.264 4×104x＋2.566 3×103，r＝0.999 9；異葒草苷在 2.625～105.000 μg／mL質(zhì)量濃度范圍呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y＝2.759 7×104x＋1.905 2×103，r＝0.999 9；異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷在 4.725～189.000 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y＝1.628 9×104x＋3.732 4×103，r＝0.999 9。

圖2 三葉青藤葉配方顆粒高效液相色譜圖

2.7 常溫留樣試驗 取三葉青藤葉配方顆粒三批，室溫條件下放置，于 0、1、2、3 月取樣考察穩(wěn)定性。 結(jié)果表明：三葉青藤葉配方顆粒各項考察指標未見明顯變化，即性狀、鑒別、水分檢查均符合規(guī)定，且與0 月比較，含量測定結(jié)果均高于各批次平均含量的90%，提示三葉青藤葉配方顆粒常溫下質(zhì)量穩(wěn)定。 水分及含量測定結(jié)果見表1。

2.8 影響因素試驗

2.8.1 高溫試驗 取三葉青藤葉配方顆粒三批，60℃條件下放置 10 d，于 0、5、10 天取樣考察。 實驗結(jié)果表明：三葉青藤葉配方顆粒各項考察指標未見明顯變化，即性狀、鑒別、水分檢查均符合規(guī)定，且與0 天比較，含量測定結(jié)果均高于各批次平均含量的90%，提示三葉青藤葉配方顆粒高溫條件下質(zhì)量穩(wěn)定。 水分及含量測定結(jié)果見表1。

2.8.2 高濕試驗 取三葉青藤葉配方顆粒三批，溫度25℃、相對濕度75 %條件下放置10 d，分別于0、5、10 天取樣考察。 實驗結(jié)果表明：三葉青藤葉配方顆粒性狀、鑒別等各項考察指標均符合規(guī)定，與0 天相比，含量測定結(jié)果高于各批次平均含量的90%；其中配方顆粒的水分測定結(jié)果有所增加（仍在規(guī)定范圍內(nèi)），出現(xiàn)吸濕增重。 提示三葉青藤葉配方顆粒在高濕條件下質(zhì)量較穩(wěn)定，在生產(chǎn)、設(shè)計包裝、貯存時應(yīng)注意配方顆粒的吸潮問題。 水分及含量測定結(jié)果見表1。

3 討 論

3.1 聚酰胺薄膜既能分離水溶性物質(zhì)，也可以分離脂溶性物質(zhì)，與各極性分子產(chǎn)生強弱不同的氫鍵吸附能力，使之分離。 采用聚酰胺薄膜，選擇三葉青藤葉配方顆粒的主要效應(yīng)組分綠原酸、異葒草苷、異葒草苷-2'-O-鼠李糖苷為對照，同時與三葉青藤葉對照藥材飲片對照，鑒別配方顆粒，以36%乙酸為展開劑時分離效果較好，斑點分離效果最佳，陰性對照無干擾。

3.2 依據(jù)課題組研究建立的三葉青藤葉配方顆?？傸S酮含量測定法，選取其中含量較高且較容易獲得的效應(yīng)組分代表異葒草苷為對照指標，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法，在供試品溶液和對照品溶液顯色后的最大吸收波長500 nm 處測定，從整體上定量控制其有效部位總黃酮含量。另外，采用HPLC 法同時測定三葉青藤葉配方顆粒5 個效應(yīng)組分含量，從多指標層面定量控制配方顆粒質(zhì)量。經(jīng)方法學考察，含量測定的準確度、精密度、靈敏度良好，為配方顆粒質(zhì)量標準含量測定法及其穩(wěn)定性考察奠定了準確的分析方法基礎(chǔ)。

3.3 將三葉青藤葉配方顆粒樣品在常溫、或暴露在空氣中接受高溫、高濕環(huán)境的考驗，考察各項評價指標的變化，為貯藏、工藝穩(wěn)定提供參考。 結(jié)果提示影響因素試驗中，濕度是影響三葉青藤葉配方顆粒穩(wěn)定性的主要因素之一，高濕環(huán)境下，配方顆粒出現(xiàn)吸濕，水分含量有所增加；同時提示需關(guān)注制備工藝過程的中間體噴霧干燥粉，避免出現(xiàn)吸潮；另外，溫度，尤其在高溫下對配方顆粒綠原酸及新綠原酸的含量也稍有影響。 因此，為確保該配方顆粒在生產(chǎn)、流通和貯藏中的質(zhì)量穩(wěn)定，提示本品包裝應(yīng)密封保存，存儲條件宜陰涼干燥。

表1 三葉青藤葉配方顆粒常溫、高溫、高濕穩(wěn)定性試驗水分及總黃酮和效應(yīng)組分群含量考察結(jié)果