陳 強(qiáng)，張 華，沙 玫，劉永靜

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

荷葉（Folium Nelumbinis）為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥葉，被《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［1］（2015 年版）收錄，主要用于暑熱煩渴、暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、血熱吐衄、便血崩漏等［1］。荷葉化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要含有生物堿、黃酮、鞣質(zhì)、有機(jī)酸等有效成分［2］。 大量研究表明：荷葉具有多種藥理作用，例如降脂減肥、降糖、抑菌和抗氧化［3］等。 近年來的研究更進(jìn)一步表明：荷葉生物堿類化合物是荷葉降脂減肥功效的主要生物活性物質(zhì)［4］，是一種具有廣闊開發(fā)前景的植物來源的減肥資源，但是現(xiàn)階段對(duì)于荷葉生物堿的質(zhì)量控制大多數(shù)是以單一荷葉生物堿的含量作為指標(biāo)，單一生物堿的含量不能完全反映生物堿的特征。 一測(cè)多評(píng)法是利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測(cè)定一個(gè)成分（對(duì)照品可得到者）實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分（對(duì)照品難以得到或難供應(yīng)）的同步測(cè)定，具有檢測(cè)成本低、分析效率高等優(yōu)點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定了荷葉中N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿和蓮堿的含量，并以荷葉堿為內(nèi)標(biāo)物，利用以上4 種生物堿類成分內(nèi)在的函數(shù)和比例關(guān)系，得出N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、蓮堿與荷葉堿之間的相對(duì)校正因子fR［5-6］，建立同時(shí)測(cè)定4 種生物堿的一測(cè)多評(píng)法［7-12］，為荷葉藥材多指標(biāo)定量測(cè)定提供一種新的分析模式。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 U-3000 高效液相色譜儀和UV 檢測(cè)器（美國(guó) DIONEX 公司）；XS105 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500E 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 N-去甲基荷葉堿對(duì)照品（純度≥98%，南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：16062601）；O-去甲基荷葉堿對(duì)照品（純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：M17M 9556201）；蓮堿對(duì)照品（純度≥98.0%，成都普思生物科技有限公司，批號(hào)：PS010846）；荷葉堿對(duì)照品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：W03J8Z27223）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，西隴化工有限公司）；Milipore 超純水、三乙胺（分析純，西隴化工有限公司）；冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。 荷葉藥材產(chǎn)自湖南，購(gòu)自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取N-去甲荷葉堿、O-去甲荷葉堿、荷葉堿和蓮堿4 種對(duì)照品各5.23、4.98、4.92、1.96 mg，分別置 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液N-去甲荷葉堿、O-去甲荷葉堿、荷葉堿和蓮堿各 1.0、0.5、1.0、1.0 mL至25 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取荷葉藥材粗粉約0.1 g，精密稱定，精密加入10 mL 甲醇，超聲30 min，濾過，精密吸取續(xù)濾液1 mL，再加1 mL 甲醇稀釋，混勻，過0.45 μm 有機(jī)相膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（49∶49.2∶1.25∶0.48）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 270 nm；流速為 1 mL／min；柱溫為 30 ℃；進(jìn)樣量為 10 μL。

精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。 拖尾因子在0.95～1.05，理論塔板數(shù)以荷葉堿計(jì)大于2 000。 混合對(duì)照品溶液、供試品溶液HPLC 圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液、供試品溶液HPLC 圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取空白溶劑10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。 結(jié)果顯示空白溶劑在對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置處未見色譜峰，方法專屬性良好。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取混合對(duì)照品溶液，分別精密進(jìn)樣 1、2、5、10、20 μL，以對(duì)照品的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立荷葉中4 個(gè)生物堿成分定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各成分在各自范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 4 種生物堿線性回歸方程

2.3.3 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿和蓮堿的峰面積的RSD，分別為 1.8%、1.3%、0.4%、1.2%（n＝6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批荷葉藥材粉末6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”色譜條件分別進(jìn)樣分析，分別計(jì)算4 個(gè)化合物的平均含量及其RSD。結(jié)果顯示：荷葉藥材中N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿和蓮堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為 0.15%、0.06%、0.30%、0.04%，RSD 值分別為1.6%、1.0%、0.3%、0.9%（n＝6）。 結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量（N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿和蓮堿的含量分別為0.14%，0.07%，0.28%，0.04%）的荷葉藥材粉末約0.05 g，共6 份，分別精密加入適量N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿和蓮堿對(duì)照品儲(chǔ)備液 150、50、300、100 μL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”色譜條件分別進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿和蓮堿的含量，求得平均回收率。 見表2。 結(jié)果顯示：N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿和蓮堿的平均回收率分別為101.16%、98.73%、101.06%、95.95%，RSD 值分別為 1.93%、1.75%、1.33%、2.00%。 結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度良好。

表2 4 種生物堿回收率

2.4 相對(duì)校正因子的確定

2.4.1 待測(cè)組分相對(duì)校正因子的計(jì)算 根據(jù)一測(cè)多評(píng)法的原理，假設(shè)某樣品中含有多個(gè)組分，選取其中1 個(gè)組分k 為內(nèi)標(biāo)，建立組分k 與其他組分m之間的相對(duì)校正因子：fkm＝fk／fm＝（Wk×Am） ／（Wm×Ak），由此可以導(dǎo)出定量計(jì)算公式：Wm＝（Wk×Am） ／（fkm×Ak），式中：Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物濃度，Am為其他組分m 峰面積，Wm為其他組分m濃度。

選擇荷葉堿為內(nèi)標(biāo)成分，分別計(jì)算O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和蓮堿的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表3。由表3 可知，N-去甲基荷葉堿、O-去甲基荷葉堿和蓮堿的fR值分別為0.99、1.37、3.16。

2.4.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察 首先，分別考察了島津LC2030、戴安U-3000 2 個(gè)品牌的高效液相色譜儀對(duì)相對(duì)校正因子的影響，分別精密吸取各濃度混合對(duì)照品溶液10 μL，利用上述兩種儀器進(jìn)行進(jìn)樣分析，計(jì)算各個(gè)校正因子。 結(jié)果表明不同的高效液相色譜儀對(duì)相對(duì)校正因子影響較小。

其次，在同一高效液相色譜儀（戴安U-3000）上，考察 3 種不同色譜柱（Diamonsil C18、Hypersil ODS、Phenomenex C18）對(duì)荷葉中3 個(gè)生物堿類成分相對(duì)校正因子的影響。 結(jié)果表明不同的色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響無顯著差異。

表3 3 種生物堿類成分fR

2.5 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 取不同產(chǎn)地的荷葉藥材，按照實(shí)驗(yàn)中供試品溶液制備的方法制備待測(cè)溶液，按照實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)確吸取各待測(cè)溶液10 μL，分別注入高效液相色譜儀，并按實(shí)驗(yàn)步驟“2.1”項(xiàng)中所列色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別采用傳統(tǒng)外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法計(jì)算各產(chǎn)地荷葉中的含量，結(jié)果見表4。 外標(biāo)法實(shí)測(cè)值與一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的質(zhì)量分?jǐn)?shù)值相對(duì)誤差＜3%，認(rèn)為2 種測(cè)定方法測(cè)得的荷葉生物堿含量無顯著性差異，說明一測(cè)多評(píng)法在荷葉4 種生物堿類成分含量測(cè)定研究中是可行的。

表4 一測(cè)多評(píng)與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 %

3 討 論

荷葉堿是荷葉生物堿的主要特征性成分之一，作為《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［1］（2015 年版）荷葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的成分，其對(duì)照品也容易獲得，因此本實(shí)驗(yàn)選用荷葉堿作為內(nèi)參物。 采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法測(cè)定的荷葉生物堿含量比較無顯著性差異，說明在荷葉生物堿對(duì)照品短缺的情況下，基本可以通過測(cè)定荷葉中荷葉堿含量來計(jì)算其他3 種生物堿類成分的含量。 一測(cè)多評(píng)法可以應(yīng)用到荷葉中生物堿含量測(cè)定中，建立相對(duì)校正因子，不僅節(jié)約時(shí)間及對(duì)照品資源，且測(cè)定結(jié)果也比較準(zhǔn)確。

本研究對(duì)于荷葉中4 種生物堿含量的測(cè)定方法，與《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》［1］（2015 年版）荷葉生物堿的測(cè)定方法相比，符合中藥多成分的特點(diǎn)，有利于中藥質(zhì)量控制的整體性和客觀性，更符合中藥質(zhì)量控制方法的要求，對(duì)荷葉及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義。