李林芳，楊倩，張?jiān)丛?，楊懷霞，馬婷婷

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.日間手術(shù)管理中心 2.手術(shù)室 3.臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川 瀘州646000）

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最為常見的一種惡性腫瘤，也是年輕女性最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，其發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤首位，且有不斷上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著女性的健康[3-4]。乳腺癌早期多為乳房進(jìn)行性長大的無痛性腫塊，初期不能引起患者重視，近年隨著影像技術(shù)的發(fā)展和微創(chuàng)穿刺活檢技術(shù)的應(yīng)用[5-6]，部分乳腺癌患者得以較早診治，但仍有部分患者發(fā)現(xiàn)即為中晚期。乳腺癌現(xiàn)有的主要治療方式為手術(shù)切除聯(lián)合化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療及中醫(yī)中藥輔助治療，盡管乳腺癌有多條途徑綜合治療，一旦患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]，其生存時間和生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，且綜合治療所引起骨髓抑制、免疫力降低、放射性皮炎、卵巢功能損害以及心臟神經(jīng)認(rèn)知系統(tǒng)的毒副作用，使患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，近年研究[8]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合中藥可以降低腫瘤的耐藥性和放化療的不良反應(yīng)，中藥將在腫瘤治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

柚皮素（naringenin，NAR）是柚皮苷的苷元單體，屬于天然的黃酮類化合物，溶于乙醇，不溶于水，生物利用度差，故限制了其在臨床中的應(yīng)用[9]。隨著藥物包封材料的發(fā)展和制備技術(shù)的不斷提高，NAR被逐漸發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性[10]，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝功能等[11-12]。有研究報道NAR可以通過調(diào)節(jié)多條信號通路、作用于多個靶點(diǎn)發(fā)揮其抗腫瘤作用，在直腸癌[13]、宮頸癌[14]、胃癌[15]、肺癌[16]、舌癌[17]的研究中均發(fā)現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)通路。但NAR對乳腺癌的研究較少，在不同種屬乳腺癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制尚且不清楚。本實(shí)驗(yàn)探討NAR對人和鼠的乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，尋找可能存在的調(diào)節(jié)通路，為乳腺癌的臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF7細(xì)胞和小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購于深圳艾普諾生物醫(yī)療科技有限公司，胎牛血清和DMEM購于上海中喬新舟生物科技有限公司，NAR購于美國Sigma-Aldrich公司，CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Hoechst染色試劑盒、一抗Akt、Bcl-2、Bax、CDK4、cyclinD1、MMP-9及GAPDH均購自上海碧云天生物科技有限公司。結(jié)晶紫購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分組取對數(shù)生長期的MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素的DMEM中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 天換液，每周傳代2～3次。分別將兩種細(xì)胞分為對照組與兩個濃度NAR（100、200 μg/mL）處理組，對照組給予等容積的溶媒DMSO。

1.2.2 細(xì)胞增殖測定使用CCK-8 試劑盒檢測NAR對MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞增殖的抑制情況。分別取分組后的細(xì)胞制成適當(dāng)密度的細(xì)胞懸液，每孔100 μL 約2×103個細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組設(shè)置5個復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前2 h 每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，用酶標(biāo)儀測定在450 nm 波長處各孔的吸光度值，計算MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的活力。

1.2.3 克隆形成分析取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，每孔約1 000個細(xì)胞，均勻分布，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按以上方法分組處理，作用24 h后更換為普通培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每72 h 更換培養(yǎng)液。1 周后，4% 多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS 漂洗2次，結(jié)晶紫染色30 min，ddH2O 漂洗2次，空氣中干燥。在顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞的克隆數(shù)及計算克隆形成率。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞按一定濃度接種于6孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個孔劃3道豎線，PBS 漂洗2次后立即光鏡下觀察拍照作為0 時狀態(tài)，并標(biāo)記每個觀察點(diǎn)。按以上方法分組處理，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，記錄同一個觀察點(diǎn)劃痕寬度的變化，分析MCF7細(xì)胞和4T 細(xì)胞的遷移能力。

1.2.5 Transwell 小室檢測細(xì)胞侵襲能力使用帶膜的檢測腫瘤細(xì)胞侵襲的Transwell 小室，Transwell 下室每孔加入400 μL 含10% 胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，上室加入不含血清的細(xì)胞懸液，每孔100 μL，分別含MCF7細(xì)胞、4T1細(xì)胞約2×105個，分組處理同1.2.1。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，結(jié)束后取出Transwell 小室并用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，PBS 沖洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗2次，結(jié)晶紫染色30 min，ddH2O 沖洗2次，在倒置顯微鏡下觀察拍照計數(shù)穿過小室的細(xì)胞。

1.2.6 Hoechst 凋亡染色取對數(shù)生長期的MCF7和4T1細(xì)胞接種在24孔板，分組處理作用24 h后，4% 多聚甲醛室溫固定10 min，PBS 輕搖洗3次，每次3 min，加入0.5 mL 的Hoechst 33342染色液，輕搖染色5 min，PBS 輕搖洗3次，每次3 min，熒光顯微鏡350 nm 波長下觀察拍照，并計算各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.7 Western blot 檢測檢測Akt、Bcl-2、Bax、CDK4、cyclin D1、MMP-9 及GADPH蛋白的表達(dá)水平，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，分組處理同前。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并裂解、離心，提取待測蛋白，用BCA法測量蛋白濃度并定量。提前24 h 制膠，每組以等量總蛋白上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜2 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，一抗孵育過夜，PBST 洗3次，室溫二抗孵育1.5 h，PBST 洗3次，使用BeyoECL Star 顯色試劑盒顯色曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NAR對MCF7細(xì)胞與小4T1細(xì)胞活力的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)中12.5～200 μg/mL的NAR作用MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞24 h后測細(xì)胞活力，經(jīng)分析軟件算得NAR對MCF7的IC50值為139.1 μg/mL，4T1的IC50值為99.53 μg/mL。故選擇100、200 μg/mL 2個濃度的NAR用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與各自對照組比較，兩種細(xì)胞在2個濃度的NAR處理后增殖活力均明顯降低（均P＜0.01），且呈一定的濃度與時間依賴趨勢（圖1）。

2.2 NAR對MCF7細(xì)胞與4T1細(xì)胞克隆形成能力的影響

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與各自對照組比較，兩種細(xì)胞在2個濃度的NAR處理后細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少，且NAR濃度越大，形成數(shù)目越少（均P＜0.01）（圖2）。

圖1 NAR對MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞活力對影響Figure1 The effects of NAR on the cell viability of MCF7 cells and 4T1 cells

圖2 NAR對MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的克隆形成能力分析Figure2 Analysis of the inhibitory effect of NAR on the clone formation of MCF7cells and 4T1 cells

2.3 NAR對MCF7細(xì)胞與4T1細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)檢結(jié)果顯示，NAR處理24 h后，MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的對照組以及低、高濃度NAR組細(xì)胞的相對遷移率分別為：（100.00±4.76）%、（43.84±2.33）%、（29.98±1.20）%；（100.00±2.44）%、（60.68±3.37）%、（51.31±1.47）%。與各自的對照組比較，兩種細(xì)胞在2個濃度的NAR處理后的細(xì)胞相對遷移率均明顯降低，且NAR濃度越大，細(xì)胞遷移率越低（均P＜0.01）（圖3）。

圖3 NAR對MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞遷移能力對影響Figure3 The effects of NAR on migration of MCF7 cells and 4T1 cells

2.4 NAR對MCF7細(xì)胞與4T1細(xì)胞侵襲能力對影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞對照組以及低、高濃度NAR組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目分別為：（1 908.67±69.51）個、（526.00±40.58）個、（77.33±4.93）個；（1 830.67±92.66）個、（354.00±43.10）個、（24.67±3.51）個。與各自的對照組比較，兩種細(xì)胞在2個濃度的NAR處理后穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)目均明顯減少，且NAR濃度越大細(xì)胞數(shù)目越少（均P＜0.01）（圖4）。

圖4 NAR對MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞侵襲能力的影響Figure4 The effects of NAR on invasion ability of MCF7 cells and 4T1 cells

2.5 NAR對MCF7細(xì)胞與4T1細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或碎塊致密濃染，顏色發(fā)亮發(fā)白。MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的對照組以及低、高濃度NAR組的細(xì)胞凋亡率分別為：（5.47±4.98）%、（42.57±2.72）%、（83.33±4.76）%；（3.18±2.84）%、（29.21±3.73）%、（75.31±7.34）%。與各自對照組比較，兩種細(xì)胞在2個濃度的NAR處理后凋亡率明顯增高，且NAR濃度越大凋亡率也高（均P＜0.01）（圖5）。

2.6 NAR對MCF7細(xì)胞與4T1細(xì)胞Akt通路及其他凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot法測定NAR對MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞中Akt、凋亡與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與各自對照組比較，NAR處理后的兩種乳腺癌細(xì)胞中的Akt、Bcl-2、CDK4、cyclin D1、MMP-9的表達(dá)量明顯下降，Bax表達(dá)量明顯升高，且NAR濃度越大變化程度越大（均P＜0.05）（圖6）。

圖5 NAR對MCF7 和4T1細(xì)胞凋亡的影響Figure5 The effect of NAR on apoptosis of MCF7 and 4T1 cells

圖6 NAR對MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞Akt、凋亡與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以及EMT 相關(guān)分子表達(dá)的影響Figure6 The effects of NAR on the expression of Akt,the apoptosis- and cell cycle-related proteins and the EMT-related molecules in the MCF7 cells and 4T1 cells

3 討 論

依據(jù)美國腫瘤學(xué)會2019年發(fā)表的腫瘤統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的腫瘤，發(fā)展中國家的乳腺癌發(fā)病率明顯低于發(fā)達(dá)國家[18]。我國的癌癥譜正由發(fā)展中國家向發(fā)達(dá)國家轉(zhuǎn)變，乳腺癌在我國的發(fā)病率和病死率正逐漸上升[19]。缺乏早期診斷、早期治療以及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的治療困難是乳腺癌病死率高的主要原因[20]。據(jù)研究報道在我國每年新發(fā)的病例中，大約有4%～10%的乳腺癌發(fā)現(xiàn)時即為晚期，較多的病例伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以肝、肺、腦以及骨轉(zhuǎn)移多見[21]，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲是惡性腫瘤的顯著特點(diǎn)，也是惡性腫瘤致死的首要原因[3]。手術(shù)切除聯(lián)合放化療、靶向、內(nèi)分泌治療等是乳腺癌目前主要的治療方式。隨著新輔助化療的推廣，部分保乳患者得到更高的安全性及有效性[22]，部分晚期患者也能獲得手術(shù)指征。一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，加上藥物的耐藥和毒副作用，在臨床上乳腺癌患者的治療效果及遠(yuǎn)期生存生活質(zhì)量仍是乳腺外科醫(yī)師和腫瘤醫(yī)師需要攻克的困難。

近年來，隨著國家對中醫(yī)中藥的重視，中藥在腫瘤方面的治療運(yùn)用逐漸成為研究熱點(diǎn)。NAR是從蕓香科植物柚中提取的一種天然雌激素類化合物，廣泛存在日常飲食中，已有研究發(fā)現(xiàn)NAR具有較強(qiáng)的清除自由基、抗炎、抗氧化作用。唐鏡等[12]研究表明，NAR對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲有抑制作用。在宮頸癌中發(fā)現(xiàn)，NAR可以通過促進(jìn)細(xì)胞活性氧（ROS）生成、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移[14]。在卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn)NAR通過抑制P13K/Akt信號通路上調(diào)凋亡蛋白，下調(diào)與遷移相關(guān)的蛋白，來達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移[23]。在胃癌、舌癌、直腸癌和肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)NAR可以通過P13K/Akt信號通路、Notch1/Hes1通路、p53/p21通路、Bax/Bcl-2通路以及調(diào)節(jié)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)來抑制腫瘤生長[13,15-17]。此外，研究發(fā)現(xiàn)NAR還是一種新的免疫調(diào)節(jié)劑，通過TGF-β通路參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，它還具有類雌激素作用和降低慢性代謝性疾病的作用。在炎癥損傷、抗氧化、應(yīng)激反應(yīng)時，NAR可以激活Nrf2/ARE信號通路、AMPK信號通路來保護(hù)細(xì)胞免受損傷[24-25]。NAR已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多條通路、多個靶點(diǎn)、多個組織器官細(xì)胞中具有顯著的藥用效果。

在有關(guān)三陰性乳腺癌的研究報道顯示，中藥在細(xì)胞周期信號通路、凋亡相關(guān)通路、p53信號通路、PI3K/Akt信號通路、Wnt信號通路、AMPK信號通路中具有多靶點(diǎn)調(diào)控的優(yōu)勢[26]。祝志川等[27]對乳腺侵潤型導(dǎo)管癌病例的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，AMPK信號通路能夠激活乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是P13K/Akt通路中的關(guān)鍵因子，當(dāng)磷酸化的Akt蛋白被激活后到胞質(zhì)中或胞核內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。已有研究[28-29]報道P13K/Akt通路在乳腺癌的瘤體生長、轉(zhuǎn)移及血管生成方面發(fā)揮重要作用。同時AKT信號通路可以調(diào)節(jié)下游線粒體途徑中Bcl-2和Bax的表達(dá)。Bcl-2家族蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白，其中Bcl-2蛋白可以抑制細(xì)胞的凋亡，Bax蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2和Bax在細(xì)胞死亡過程中起主要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF7和4T1細(xì)胞在NAR作用后，Akt的表達(dá)明顯下降，并出現(xiàn)Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào)的現(xiàn)象。提示NAR可能是調(diào)節(jié)Akt總蛋白的表達(dá)，來抑制P13K/Akt通路，并調(diào)節(jié)下游凋亡因子Bax和Bcl-2的表達(dá)，最終促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，這與NAR在宮頸癌、胃癌、和卵巢癌中的研究結(jié)果一致[14-15,23]。筆者后續(xù)的實(shí)驗(yàn)會對P13K/Akt通路上下游的調(diào)節(jié)分子進(jìn)行檢測，為NAR在乳腺癌細(xì)胞Akt通路的調(diào)節(jié)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。cyclin D1和CDK4是細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的關(guān)鍵因子。cyclin D1的過表達(dá)可激活CDK4，兩者正向調(diào)控具有促癌作用[30]。已有報道激素受體陽性的乳腺癌患者能從CDK4抑制劑中獲益[31]。本實(shí)驗(yàn)中，NAR作用后兩種細(xì)胞的cyclin D1和CDK4表達(dá)均降低，提示NAR可能通過細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)來抑制cyclin D1和CDK4的表達(dá)，從而阻滯MCF7和4T1細(xì)胞的生長。EMT的是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵機(jī)制。MMP-9是MMP蛋白家族的成員，是EMT機(jī)制中研究最多的分子之一。MMP-9可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管生成，加快腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP-9可以作為乳腺癌轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警和術(shù)后監(jiān)測[32]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NAR作用下MCF7和4T1細(xì)胞的MMP-9表達(dá)均下降，與NAR在直腸癌[13]的研究一致。提示NAR可能通過抑制EMT過程來下調(diào)MMP-9的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對MCF7和4T1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移達(dá)到抑制作用。后續(xù)研究將檢測NAR在乳腺癌EMT過程中其他相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，來探索NAR對乳腺癌EMT的調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上所述，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NAR可能通過抑制Akt通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和EMT過程來抑制MCF7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，但具體的確切分子機(jī)制還需繼續(xù)研究。接下來在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計中運(yùn)用小鼠腫瘤模型及基因測序等手段來進(jìn)一步探索NAR對乳腺癌形成和發(fā)展的機(jī)制。