（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 乳甲外科，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見(jiàn)的病理類型，大約占所有甲狀腺癌的80%～85%[1-2]。PTC是一種具有濾泡細(xì)胞分化及一系列核特征的上皮細(xì)胞惡性腫瘤。從臨床發(fā)病率及預(yù)后來(lái)說(shuō)，PTC是最常見(jiàn)的甲狀腺腫瘤，同時(shí)也是總體預(yù)后最好的一種甲狀腺惡性腫瘤。PTC通常表現(xiàn)為不規(guī)則的實(shí)性腫塊，但在極少數(shù)情況下，可能具有囊性特征。PTC的主要特征之一是它能夠侵入鄰近結(jié)構(gòu)，例如淋巴管。大約有10%的患者在最初被診斷時(shí)已經(jīng)具有轉(zhuǎn)移病灶，但對(duì)于年齡＜45歲的患者來(lái)說(shuō)，PTC的總體預(yù)后是較好的[3-5]。

甲狀腺癌的預(yù)后受多種因素的調(diào)節(jié)。已有許多研究報(bào)道多種因素能影響甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，microRNA（miRNA）是其中一種重要因素。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸序列的小分子RNA，能通過(guò)結(jié)合到特定信使RNA的3'UTR來(lái)抑制基因的翻譯或誘導(dǎo)降解，從而使其能夠參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的過(guò)程。據(jù)文獻(xiàn)[6-16]報(bào)道，miRNA發(fā)揮癌基因和抑癌基因的功能，參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。Chou等[17]研究表明miR-146b表達(dá)的失調(diào)與PTC侵襲與預(yù)后相關(guān)，因此可以作為一種新型的PTC生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。Minna等[18]研究表明miR-451a能作為抑癌基因并可以通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)PTC的進(jìn)展。

外泌體是一種由絕大多數(shù)細(xì)胞釋放的、具有脂質(zhì)雙分子層和豐富內(nèi)容物的微囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約30～100 nm。近10年來(lái)發(fā)現(xiàn)外泌體中不僅包含功能性蛋白，還有功能性核酸物質(zhì)，這些蛋白質(zhì)、核酸對(duì)腫瘤的進(jìn)展具有重要作用，成為腫瘤相關(guān)研究熱點(diǎn)。

本研究通過(guò)提取低危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和中高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)PTC患者血清中的外泌體并通過(guò)microarray分析，篩選差異表達(dá)的miRNA，并以此為基礎(chǔ)研究相關(guān)miRNA在調(diào)節(jié)PTC進(jìn)展中的作用，并進(jìn)一步探討其內(nèi)在信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株本研究中所使用PTC細(xì)胞TPC-1、K-1及293T細(xì)胞分別購(gòu)于中南大學(xué)、上海中科院細(xì)胞庫(kù)及ATCC 公司，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑TRIzol? Reagent、Lipofectamine?3000試劑購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix均購(gòu)自TaKaRa公司；8 μm Transwell小室、6孔盤、24 孔盤均購(gòu)于美國(guó)Corning 公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；MAP2抗體、S100PBP抗體、CLDN18抗體、PRDX6、GAPDH抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)所有細(xì)胞均在含10% 胎牛血清、1% 青霉素- 鏈霉素雙抗、1% 谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到90% 以上密度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)使用8 μm Transwell 小室進(jìn)行。先在上室加入100 μL經(jīng)1:15～1:20 稀釋的Matrigel膠，并置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中2 h 使其凝固；然后于上室加入150 L含50 000個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入含血清的培養(yǎng)基，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h后，取出上室，進(jìn)行清洗、固定、染色、顯微鏡下觀察、拍照等。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞后，PBS 洗滌2遍，離心取細(xì)胞沉淀，按照TRIzol? Reagent 說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，依據(jù)4×ReverseTranscription Master Mix 試劑盒說(shuō)明書將組織總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒說(shuō)明書操作，以cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃ 2 min，94℃ 20 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。相關(guān)miRNA 引物序列如下：hsamiR-186-5p：5'-CAA AGA ATT CTC CTT TTG GGC T-3'；hsa-miR-532-3p：5'-CCT CCC ACA CCC AAG GCT TGC A-3'；hsa-miR-199b-3p：5'-ACA GTA GTC TGC ACA TTG GTT A-3'；hsamiR-3158-5p：5'-CCT GCA GAG AGG AAG CCC TTC-3'；hsa-miR-3605-5p：5'-TGA GGA TGG ATA GCA AGG AAG CC-3'。

1.2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn)待細(xì)胞生長(zhǎng)到適宜量時(shí)，收取細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，然后依次按電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯影等步驟驗(yàn)證蛋白表達(dá)差異。

1.2.5 血清外泌體的提取及純化血清外泌體的提取及純化所使用試劑盒為上海宇玫博生物科技有限公司血清外泌體提取試劑盒（UR52136），所有操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。具體操作步驟詳見(jiàn)公司官網(wǎng)試劑盒操作規(guī)程（http://www.umibio.cn/product/278182363）。

1.2.6 基因芯片分析及差異miRNA 篩選收集了5 組確診PTC患者血液標(biāo)本，根據(jù)分化型甲狀腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)度分層（2015 版ATA 指南）為低危組（腫瘤無(wú)腺外侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）和中高危組（腫瘤有腺外侵犯或有頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移超過(guò)5個(gè)），血液標(biāo)本提取及純化獲得外泌體，然后將收集的外泌體進(jìn)行芯片測(cè)序（華大基因公司），并通過(guò)測(cè)序熱圖結(jié)果篩選差異表達(dá)miRNA。同時(shí)收集了21 組確診PTC患者的腫瘤組織標(biāo)本，對(duì)差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行驗(yàn)證?；颊叩倪x擇及標(biāo)本的收集均通過(guò)湖南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：2017 科研倫審第11號(hào)）。

1.2.7 miR-186-5p 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制劑的信息過(guò)表達(dá) miR-186-5p 采用pLV 慢病毒質(zhì)粒，序列（上游：CGC GTC AAA GAA TTC TCC TTT TGG GCT GTC GAC AGC CCA AAA GGA GAA TTC TTT GTT TTT G，下游：CGC AAA AAC AAA GAA TTC TCC TTT TGG GCT GTC GAC AGC CCA AAA GGA GAA TTC TTT G） 由Integrated DNA Technologies 公司提供。miR-186-5p 抑制劑（Thermo Fisher Scientific公司）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至60%～80% 匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染，使用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine?3000 試劑（無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基125 μL，Lipofectamine?3000試劑5 μL），使用無(wú)血清DMEM培基稀釋DNA，制備DNA預(yù)混液，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基125 μL，抑制劑2.5 μg，在每管已稀釋的Lipofectamine?3000 試劑中加入稀釋的抑制劑（1:1），稀釋的DNA 125 μL，稀釋的Lipofectamine?3000 試劑125 μL，室溫孵育10～15 min，加入DNA-脂質(zhì)復(fù)合物至細(xì)胞中（每孔抑制劑-脂質(zhì)體復(fù)合物250 μL，抑制劑量2 500 ng，Lipofectamine?3000 試劑用量5 μL）；37℃孵育細(xì)胞2～4 d。然后分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組間差異比較采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)PTC患者血清外泌體中差異表達(dá)的miRNA

提取5組低危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)與中高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)PTC患者血清中的外泌體，并通過(guò)microarray分析兩組之間差異表達(dá)的miRNA，結(jié)果顯示，中高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)PTC患者血清外泌體中4個(gè)miRNA（miR-186-5p、miR-532-3p、miR-199b-3p、miR-3158-5p）表達(dá)上調(diào)，1個(gè)miRNA（miR-3605-5p）表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 microarray 分析PTC患者血清外泌體中差異表達(dá)的miRNA（P1、P3、P5、P7、P9為中高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)PTC患者樣本，P2、P4、P6、P8、P10為低危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的PTC患者樣本；紅色表示表達(dá)升高，綠色表示表達(dá)降低）Figure1 Microarray analysis of differentially expressed miRNAs in serum exosomes of PTC patients (P1,P3,P5,P7,P9:samples from PTC patients with intermediatehigh recurrence risk,P2,P4,P6,P8,P10:samples from PTC patients with low recurrence risk; red color standing for high expression,green color standing for low expression)

2.2 PTC患者癌組織中相關(guān)miRNA表達(dá)驗(yàn)證

通過(guò)qRT-PCR方法分別驗(yàn)證低危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和中高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者各21例PTC組織中上述5個(gè)miRNA表達(dá)情況，結(jié)果表明，miR-186-5p和miR-3158-5p在中高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者的腫瘤組織中表達(dá)高于低危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者的PTC組織（均P＜0.05）（圖2）。

圖2 qRT-PCR 驗(yàn)證PTC 組織中相關(guān)miRNA表達(dá)情況Figure2 Expression of the related miRNAs in PTC tissues verified by qRT-PCR

2.3 miR-186-5p 與miR-3158-5p對(duì)PTC細(xì)胞的侵襲能力的影響

進(jìn)一步在兩種PTC細(xì)胞（TPC-1、K-1）中過(guò)表達(dá)miR-186-5p/miR-3158-5p或加入相應(yīng)的miR-186-5p/miR-3158-5p抑制劑后檢測(cè)PTC細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-186-5p能增加PTC細(xì)胞侵襲能力，加入mmiR-186-5p抑制劑能抑制PTC細(xì)胞的侵襲能力（均P＜0.05），而miR-3158-5p的表達(dá)狀態(tài)對(duì)PTC細(xì)胞的侵襲能力沒(méi)有影響（均P＞0.05）（圖3）。

圖3 不同miR-186-5p 或miR-3158-5p表達(dá)狀態(tài)對(duì)PTC細(xì)胞侵襲能力的影響Figure3 Influences of different expression statuses of miR-186-5p or miR-3158-5p on invasion ability of PTC cells

2.4 miR-186-5p 靶基因預(yù)測(cè)與鑒定

為了探討miR-186-5p通過(guò)何種下游分子調(diào)控PTC細(xì)胞的侵襲能力，首先通過(guò)OncomiR在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.oncomir.org/oncomir/search_target_miR.html）預(yù)測(cè)了miR-186-5p潛在作用的靶基因，結(jié)果顯示，PRDX6、S100PBP、CLDN18、MAP2可能被miR-186-5p調(diào)控（圖4）。進(jìn)一步在PTC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-186-5p后檢測(cè)PTC細(xì)胞中相應(yīng)的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示CLDN18表達(dá)下降，當(dāng)加入miR-186-5p抑制劑時(shí)，CLDN18表達(dá)升高，而其他蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（圖5）。

圖4 OncomiR 在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-186-5p 潛在靶基因Figure4 Potential targets of miR-186-5p predicted through OncomiR database

圖5 過(guò)表達(dá)或敲低miR-186-5p 對(duì)PTC細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響Figure5 Influence of miR-186-5p overexpression and knock-down on protein expressions of the related genes

2.5 miR-186-5p 靶基因的功能分析與驗(yàn)證

侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CLDN18能抑制PTC細(xì)胞的侵襲，而敲低CLDN18能促進(jìn)PTC細(xì)胞的侵襲能力（均P＜0.05）（圖6）。進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)或敲低miR-186-5p對(duì)PTC細(xì)胞的作用被同時(shí)過(guò)表達(dá)或敲低CLDN18所逆轉(zhuǎn)（均P＜0.05）（圖7）。使用GEPIA在線網(wǎng)站（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PTC臨床標(biāo)本中CLDN18表達(dá)情況，結(jié)果顯示與正常甲狀腺組織相比，PTC腫瘤組織中CLDN18表達(dá)降低（圖8），提示CLDN18可能是PTC的抑癌基因，這與其他腫瘤中相關(guān)報(bào)道一致[19]。

圖6 不同CLDN18表達(dá)狀態(tài)對(duì)PTC細(xì)胞侵襲能力的影響Figure6 Influence of different CLDN18 status on invasion capacity of PTC cells

圖7 CLDN18 對(duì)miR-186-5p 的逆轉(zhuǎn)作用 A：miR-186-5p 抑制劑同時(shí)敲低CLDN18 或同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-186-5p及CLDN18后PTC細(xì)胞侵襲能力的變化；B：miR-186-5p 抑制劑同時(shí)敲低CLDN18 或同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-186-5p及CLDN18后PTC細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的變化Figure7 Reversal effects of CLDN18 on actions of miR-186-5p A:Change in invasion ability of PTC cells after miR-186-5p inhibitor treatment with simultaneous CLDN18 knock-down or both miR-186-5p and CLDN18 overexpression; B:Change in expressions of the relevant proteins in PTC cells after miR-186-5p inhibitor treatment with simultaneous CLDN18 knock-down or both miR-186-5p and CLDN18 overexpression

圖8 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析甲狀腺腫瘤組織及正常組織中CLDN18表達(dá)情況Figure8 Analysis of CLDN18 expression in thyroid tumor and normal tissue through GEPIA database

3 討 論

甲狀腺癌是源自內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，其發(fā)病率正在逐年上升[20-24]。根據(jù)美國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2020年預(yù)計(jì)新增甲狀腺癌患者52 890例，同時(shí)預(yù)計(jì)將有新增死亡2 180例[24]。PTC是甲狀腺癌最常見(jiàn)的病理類型，與其他惡性腫瘤相比，PTC預(yù)后較好，90%的PTC患者可以長(zhǎng)期生存，但其復(fù)發(fā)率仍高達(dá)30%。雖然目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了甲狀腺乳頭狀癌的診斷和術(shù)后監(jiān)測(cè)技術(shù)，但是由于診斷的陰性率以及相關(guān)干擾因素的存在，并且缺乏PTC預(yù)后的特定標(biāo)志，使得PTC仍然是臨床醫(yī)生面臨的難題。

miRNA是一種小的非編碼RNA，能夠通過(guò)切割靶信使RNA或抑制靶基因翻譯的方式來(lái)抑制靶基因的表達(dá)[25]。近年的研究[26]表明miRNA可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化，促進(jìn)或抑制腫瘤的惡性表型，相比正常細(xì)胞，腫瘤組織中miRNA存在明顯異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的miRNA在腫瘤形成中扮演重要角色，可作為腫瘤病因?qū)W、生物學(xué)特性、組織分型和臨床分級(jí)分期的分子標(biāo)志物。韋維等[27]研究表明，與人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 比較，miR-124在各胃癌細(xì)胞中的表達(dá)均明顯降低，進(jìn)一步機(jī)制分析表明miR-124表達(dá)的下調(diào)可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡。Yoshizawa等[28]研究表明尿液外泌體中的miR-3940-5p/miR-8069比值可以作為胰腺導(dǎo)管腺癌的新型診斷生物標(biāo)志物。Rashad等[29]研究表明血清miRNA-27a和miRNA-18b可作為丙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。以此為基礎(chǔ)，本研究通過(guò)檢測(cè)PTC患者血清外泌體中miRNA含量，并通過(guò)芯片分析技術(shù)篩選出低危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和中高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的PTC患者血清中差異表達(dá)的5個(gè)miRNA，然后將上述5個(gè)miRNA在臨床組織標(biāo)本中進(jìn)一步分析，得出miR-186-5p可能在PTC侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，并通過(guò)功能試驗(yàn)和逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-186-5p可以促進(jìn)PTC的侵襲，從而進(jìn)一步證實(shí)了miRNA在促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用。

miRNA能通過(guò)結(jié)合到特定信使RNA的3'UTR來(lái)抑制基因的翻譯或誘導(dǎo)降解，從而使其能夠參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的過(guò)程，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)。本研究通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)分析并通過(guò)相關(guān)蛋白印跡、功能試驗(yàn)及逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，得出miR-186-5p可通過(guò)調(diào)節(jié)下游CLDN18基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)PTC進(jìn)展。CLDN18屬于Claudin家族中的一員。Claudin是完整的膜蛋白，是緊密連接鏈的組成部分。緊密連接鏈可充當(dāng)物理屏障，以防止溶質(zhì)和水自由通過(guò)上皮或內(nèi)皮細(xì)胞片之間的細(xì)胞旁空間，并且在維持細(xì)胞極性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起著關(guān)鍵作用。該基因在潰瘍性結(jié)腸炎患者中上調(diào)，在浸潤(rùn)性導(dǎo)管腺癌中高度表達(dá)。PKC/MAPK/AP-1（蛋白激酶C/絲裂原活化蛋白激酶/激活蛋白-1）依賴性途徑可調(diào)節(jié)該基因在胃細(xì)胞中的表達(dá)。CLDN18在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用，可作為原癌基因/抑癌基因調(diào)節(jié)不同腫瘤的進(jìn)展。Wan等[30]研究表明CLDN18可作為原癌基因促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲。Zhang等[19]研究表明CLDN18可作為抑癌基因抑制胃癌細(xì)胞的進(jìn)展。本研究中miR-186-5p能抑制CLDN18基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)PTC細(xì)胞的侵襲能力，進(jìn)一步驗(yàn)證了CLDN18能作為抑癌基因來(lái)抑制PTC的進(jìn)展。

綜上所述，miR-186-5p在中高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)PTC患者的血清外泌體及腫瘤組織中都表達(dá)升高，同時(shí)可以促進(jìn)PTC細(xì)胞的侵襲能力，其表達(dá)狀態(tài)可能與PTC的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，其機(jī)制可能與抑制下游CLDN18基因表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果可為PTC的診斷及基因治療提供理論依據(jù)。